溫海燕，宋金春

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060）

膦甲酸鈉為非核苷類廣譜抗病毒藥物，體內(nèi)外研究表明，能有效抑制乙型病毒性肝炎（簡(jiǎn)稱乙肝）病毒DNA的復(fù)制，目前已用于慢性乙肝或重度乙肝的治療［1］?？鄥⑺刈⑸湟旱闹饕煞譃檠趸鄥A（含量＞98%），是從中藥植物苦參及苦豆子中提取的生物堿，臨床主要用于慢性乙肝、肝纖維化等疾病的輔助治療，具有一定的抗病毒作用［2］。作為《慢性乙型肝炎防治指南》唯一推薦的抗病毒中藥，苦參素能有效降低乙肝病毒DNA水平，還有保護(hù)肝臟、抗肝纖維化、消炎、免疫調(diào)節(jié)等多重作用［3］。近年來(lái)的大量研究表明，苦參素和膦甲酸鈉對(duì)體內(nèi)外的乙肝病毒具有良好的抑制作用［4-5］。兩藥聯(lián)用治療重度慢性肝炎安全有效，可明顯促進(jìn)患者肝功能的恢復(fù)，但少數(shù)患者出現(xiàn)頭暈、惡心、乏力等輕微不良反應(yīng)［6］。本研究中對(duì)膦甲酸鈉和苦參素在不同條件下體外配伍的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WD-A型藥物穩(wěn)定性檢查儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；TG328A型電子分析天平（上海天平儀器廠）；UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；雷磁PHS-25型pH計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

膦甲酸鈉氯化鈉注射液（武漢大安制藥有限公司，規(guī)格為每瓶250 mL∶膦甲酸鈉3 g∶氯化鈉2.5 g，批號(hào)為21707061-1）；苦參素注射液（江蘇正大天晴制藥有限公司，規(guī)格為每支 2 mL∶苦參堿 0.6 g，批號(hào)為160824204）；膦甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（上海扶生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)為FS-1490，純度≥99%）；苦參素對(duì)照品（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)為D1408005，規(guī)格為100 mg，純度為98.14%）；甲醇為色譜純；四己基硫酸氫銨、磷酸二氫鈉、三乙胺均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：40 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（含 0.25 mmol／mL四己基硫酸氫銨和 50 mmol／L 三乙胺，pH ＝7.6）-甲醇（V ／V，75 ∶25）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品貯備液：分別稱取膦甲酸鈉和苦參素對(duì)照品120 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相定容至刻度，即得。

對(duì)照品配伍液：按照臨床配伍，稱取膦甲酸鈉對(duì)照品0.3 g和苦參素對(duì)照品0.06 g，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，即得。

供試品配伍液：按臨床配伍，取膦甲酸鈉氯化鈉注射液250 mL，注入苦參素注射液2 mL，震蕩混勻，即得。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

分別量取上述已配制的膦甲酸鈉和苦參素對(duì)照品貯備液適量，均用流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度為5 μg／mL，得紫外樣品。在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，分別得膦甲酸鈉和苦參素的紫外光譜圖，兩種樣品圖譜交點(diǎn)對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)230 nm即為高效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取對(duì)照品貯備液，采用流動(dòng)相分別稀釋至 2，4，5，6，8，10 倍，各取 20 μL 進(jìn)樣，按照 2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，分別以膦甲酸鈉和苦參素的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，膦甲酸鈉為 Y＝536.81X-17 398，R2＝0.999 7（n＝6）；苦參素為 Y ＝4 606.6 X-39 912，R2＝0.9997（n ＝6）。結(jié)果表明，膦甲酸鈉和苦參素質(zhì)量濃度均在0.1～1.2 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別取標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1 g／L膦甲酸鈉和0.20 g／L的苦參素對(duì)照品溶液各20μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度的 RSD磷甲酸鈉為 1.55% （n＝5）、苦參素為 1.63% （n＝5），日間精密度的 RSD磷甲酸鈉為1.64%（n＝5）、苦參素為1.71% （n ＝5），表明儀器精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取膦甲酸鈉氯化鈉注射液和苦參素注射液，平行制備供試品配伍液6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果膦甲酸鈉和苦參素峰面積的 RSD分別為1.43%和1.52%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按照2.1.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品配伍液各 5 份，搖勻。置常溫下，分別于 0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果膦甲酸鈉和苦參素峰面積的 RSD分別為1.32% 和 1.35% （n ＝5），表明膦甲酸鈉與苦參素對(duì)照品配伍液在室溫8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：稱取膦甲酸鈉原料藥和苦參素各9份，均分為3組，精密稱定，置100 mL容量瓶中，每組中分別加入高（120.00%）、中（100.00%）、低（80.00%）濃度的膦甲酸鈉與苦參素對(duì)照品，用流動(dòng)相稀釋定容，再用超純水稀釋5倍，取上述稀釋溶液各20 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 配伍穩(wěn)定性考察

配伍液制備：按照2.2項(xiàng)下制備供試品配伍液，搖勻。置不同條件下，稀釋10倍后，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，考察不同條件對(duì)膦甲酸鈉和苦參素配伍液的影響。

不同條件下配伍液圖譜：取2.1.1項(xiàng)下供試品配伍液，分別置強(qiáng)光照射、高溫（60℃）條件下放置8 h后進(jìn)樣，觀察圖譜變化。結(jié)果見(jiàn)圖1。

配伍液的外觀及pH變化：將供試品配伍液分別置4 ℃、（23 ±2）℃ （室溫）及 45 ℃ （高溫）條件下，分別于0，8，12，24，48，72，96，120，168，240，360 h 時(shí)觀察上述配伍液外觀是否有渾濁、沉淀、云狀物、氣泡、變色［控制條件，相對(duì)濕度（25±5）%，避光］。結(jié)果在 15 d內(nèi)配伍液澄清，無(wú)渾濁、變色現(xiàn)象，未發(fā)生沉淀。在上述不同時(shí)間配伍液的pH變化見(jiàn)表2。

配伍液含量變化：分別在 0，2，4，8，24，48，72，96，120，168，240，360 h時(shí)抽取上述供試品配伍液，用超純水將抽取液稀釋5倍，照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算配伍溶液中2種藥物的含量。在4℃條件下，樣品含量較穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)15 d后仍大于90%；而在室溫及45℃條件下，樣品含量開始下降，且在15 d內(nèi)含量小于90%，認(rèn)為其含量不穩(wěn)定。在4℃，（23±2）℃和45℃下，膦甲酸 鈉質(zhì)量濃度分別為 （2.29 ±0.07）g／L，（2.26 ±0.08）g／L，（2.18 ±0.11）g／L，苦參素質(zhì)量濃度分別為 （0.45 ±0.02）g／L，（0.45 ±0.01）g ／L，（0.44 ±0.02）g／L。相對(duì)百分含量見(jiàn)表 3。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

圖1 不同條件下配伍液高效液相色譜圖

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

參考文獻(xiàn)［7-9］，對(duì)不同的液相條件進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)流動(dòng)相的條件進(jìn)行選擇和調(diào)整，最終選擇文中所用流動(dòng)相。其中四己基硫酸氫銨作為離子對(duì)試劑，能有效與膦甲酸鈉結(jié)合，使其在色譜柱上能有效保留；而加入三乙胺，能減少苦參素的拖尾，改善峰形。在此條件下，可以獲得較滿意的峰形，出峰時(shí)間適宜，且膦甲酸鈉和苦參素分離度較好，可同時(shí)測(cè)定兩者的含量。

表3 膦甲酸鈉與苦參素配伍相對(duì)百分含量變化試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3.2 不同條件對(duì)峰形和保留時(shí)間的影響

由于藥品通常于避光、陰涼環(huán)境下保存，而在配伍制備的過(guò)程中，通常會(huì)受到光照、溫度等不同環(huán)境因素的影響。因此，對(duì)高溫（60℃）、強(qiáng)光照條件下放置8 h的樣品進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，在以上條件下，色譜峰的保留時(shí)間和峰形均未受影響。

3.3 不同條件對(duì)配伍含量的影響

在藥物配伍過(guò)程中，時(shí)間、溫度等條件的改變，易使其穩(wěn)定性和含量發(fā)生變化，從而影響其藥理和生化活性［10］。一般來(lái)說(shuō)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高，由于可能產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定性和藥物含量下降，故需對(duì)其長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行考察［11］。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，兩者配伍液在4℃條件下含量變化較穩(wěn)定，而在室溫和45℃條件下藥物含量明顯下降，提示兩者配伍應(yīng)保存于低溫條件下盡快使用。

綜上所述，膦甲酸鈉和苦參素按臨床常用劑量進(jìn)行配伍，穩(wěn)定性較好，液體澄清，pH穩(wěn)定。但本研究中僅對(duì)物理化學(xué)變化做了初步探究，未對(duì)其長(zhǎng)期使用的微生物等生物污染進(jìn)行考察，故在臨床應(yīng)用中需現(xiàn)配現(xiàn)用。

表2 膦甲酸鈉和苦參素配伍液不同溫度條件下不同時(shí)間pH測(cè)定結(jié)果（n＝5）