馬建麗，李 翔，段斯庭，焦美燕，魏婷婷，黎春彤，孟凡爽

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科，北京 100048）

洋蔥是藥食兩用植物，含有硫化物、類黃酮、多糖等主要化學(xué)成分，有顯著的抗氧化、抗癌、抗血小板聚集、抑菌消炎、降血壓、降血糖、調(diào)血脂等功效［1］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于硫化物、類黃酮等物質(zhì)的研究報(bào)道較多，而有關(guān)洋蔥多糖的研究甚少。洋蔥多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基均有較好的清除能力，具有較高的研究?jī)r(jià)值［2］。本研究中采用熱水提醇沉法提取洋蔥總多糖，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳工藝條件，還測(cè)定了洋蔥多糖含量，為其進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BJ-400型高速多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；DZF-6053型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；N-1100D-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（愛(ài)朗科技國(guó)際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；LD5-2A型離心機(jī)（北京京立醫(yī)療器械公司）；LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠）；Evolution 201型紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試藥

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110833-201707）：無(wú)水乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸，均為分析純；純化水為本制劑室自制。將新鮮黃皮洋蔥（市場(chǎng)購(gòu)買）切碎，在60℃真空干燥箱中烘至無(wú)水分，置40℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎，制得干燥洋蔥粉，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 溶液制備

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品99.80mg，置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，取10 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，配置成質(zhì)量濃度為99.80 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存。

5%苯酚試劑：將盛有苯酚的棕色玻璃瓶置60℃水浴鍋中，待其融為液態(tài)后稱取苯酚4.999 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，取水稀釋至刻度，搖勻，避光保存［3］。

樣品溶液：稱取洋蔥多糖6 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水80 mL，超聲30 min，冷卻至室溫，定容至100 mL，搖勻，備用。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

精密量取溶液0.5 mL，置10 mL試管中，再加入5% 苯酚試劑 0.3 mL，混勻，加濃硫酸 1.5 mL，立即混勻，依次置40℃水浴中放置30 min，冰水浴中放置5 min，測(cè)定前放置至室溫。在400～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，在490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。詳見(jiàn)圖1。

圖1 樣品紫外吸收光譜圖

2.1.3 方法學(xué)考察

基坑作為作業(yè)區(qū)必須劃出禁區(qū)，并設(shè)置圍欄，帶有‘施工現(xiàn)場(chǎng)，行人不得入內(nèi)’字樣的安全警示牌，禁止行人進(jìn)入，以免造成安全事故。施工人員進(jìn)入施工現(xiàn)場(chǎng)時(shí)，要進(jìn)行人員審核，并檢查施工人員的安全配置是否符合安全管理要求。

線性關(guān)系考察：精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2，4，6，8，10 mL，置10 mL容量瓶中，分別加水至刻線，搖勻，得質(zhì)量濃度為 19.96，39.92，49.90，79.84，99.80 μg ／mL的對(duì)照品溶液。按2.1.2項(xiàng)下操作至“測(cè)定前放置至室溫”，測(cè)定吸光度，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.011 5X+0.008 3，R2＝0.994 2（n ＝5），進(jìn)樣量線性范圍為 9.980 ～49.90 μg。

精密度試驗(yàn)：精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，取6 份，同 2.1.2 項(xiàng)下“加入 5%苯酚試劑 0.3 mL”余下操作，測(cè)定吸光度值。結(jié)果的 RSD為2.49% （n＝6），表明儀器精密度良好。。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別稱取洋蔥多糖提取物6份，精密稱定，按2.1.1項(xiàng)下方法處理樣品，分別精密吸取此溶液0.5 mL置試管中，同2.1.2項(xiàng)下“加入5%苯酚試劑0.3 mL”余下操作，測(cè)定吸光度值。結(jié)果洋蔥多糖平均含量為 61.84%，RSD 為 2.68% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：稱取洋蔥多糖提取物，精密稱定，按2.1.1 項(xiàng)下方法處理樣品，精密吸取 0.5 mL，按 2.1.2項(xiàng)下“加入5%苯酚試劑0.3 mL”余下操作，每隔20 min測(cè)定吸光度值，連續(xù)測(cè)定2 h。結(jié)果的 RSD為2.54%（n＝7），表明待測(cè)溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取6份已知多糖含量（61.84%）的洋蔥多糖提取物，每份3 mg，精密稱定，分別加入18 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水至80 mL，超聲處理30 min，冷卻至室溫，定容至100 mL，搖勻，分別精密吸取此溶液0.5 mL置試管中，同2.1.2項(xiàng)下“加入5%苯酚試劑0.3mL”余下操作，測(cè)定吸光度值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 多糖提取流程

稱取10 g干燥洋蔥粉，精密稱定，以固定料液比與純凈水混合放入燒杯中，將其置電熱恒溫水浴鍋中，在固定提取溫度下水浴浸提固定時(shí)間，浸提后將其放入離心機(jī)中，以3 000 r／min的速率離心5 min，用漏斗將其固液分離，得到的殘?jiān)魳?，上清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至50 mL后取出，備用。

2.2.2 去蛋白純化處理

加入濃縮液體積1／5的三氯甲烷，再加入三氯甲烷體積1／5的正丁醇，混合后，超聲20 min，以3 000 r／min的速率離心5 min，除去變性蛋白質(zhì)沉淀，取水相，以1∶1的比例加入無(wú)水乙醇，靜置2 h使多糖沉淀后將其放入離心機(jī)中，以3 000 r／min的速率離心5 min，用漏斗將其固液分離，上清液留樣，沉淀用丙酮洗滌5次，將得到的多糖沉淀放入冰箱冷凍12 h，再放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，得到多糖［3］。

2.2.3 單因素試驗(yàn)

料液比：分別配置料液比為 1 ∶10，1 ∶15，1 ∶20，1∶25，1∶30的樣品5份，置70℃水浴中提取1 h，考察洋蔥多糖提取率。

提取時(shí)間：分別將預(yù)處理好的料液比為1∶20的樣品置 70 ℃水浴中，分別提取 1，2，3，4，5 min，考察洋蔥多糖提取率。

提取溫度：分別將預(yù)處理好的料液比為1∶20的樣品置 50，60，70，80，90 ℃水浴中，提取 1 h，考察溫度對(duì)洋蔥多糖提取率的影響［4］。

2.2.4 正交試驗(yàn)

選取料液比（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取溫度（因素C）作為考察因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2。分別對(duì)正交試驗(yàn)所得的9份樣品，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定含量，并以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。3個(gè)因素對(duì)多糖提取率影響強(qiáng)度為料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間；最佳提取工藝料液比為1∶20，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為2 h，此時(shí)洋蔥多糖提取率理論上為最大值。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表 3 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)最佳工藝條件提取3次，結(jié)果總多糖的提取率分別為 4.60% ，4.42% ，4.56% ，與預(yù)測(cè)一致，表明正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件重復(fù)性好。

3 討論

3.1 提取方法

文獻(xiàn)中常采用熱水提醇沉法、超聲輔助提取法、回流超聲輔助提取法［5-7］提取洋蔥多糖。熱水提醇沉法的優(yōu)點(diǎn)是安全、無(wú)毒且成本低。提取過(guò)程中，由于提取到的多糖較少，故減少其損失顯得很有必要，即離心過(guò)濾這一步很重要，如果過(guò)濾時(shí)采用濾紙，會(huì)導(dǎo)致多糖很大一部分殘留在濾紙上，從而降低多糖的得率，因此在實(shí)際過(guò)濾中可使用紗布。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，多糖大都采用冷凍干燥［8］，而不用真空干燥，原因是真空干燥會(huì)導(dǎo)致提取出來(lái)的多糖呈黏彈性，不是理想中的粉末狀，而冷凍干燥的效果則很好。

3.2 含量測(cè)定

苯酚-硫酸法是測(cè)定多糖含量的最常用方法。在濃硫酸作用下，多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，并通過(guò)比色法確定含量，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好、顯色后穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，文獻(xiàn)中常采用此方法測(cè)定多糖含量。蒽酮-硫酸法雖也能測(cè)定多糖含量，但穩(wěn)定性較差，此外，色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)有一定干擾，故一般不采用此法對(duì)多糖進(jìn)行含量測(cè)定［9-11］。苯酚-硫酸法的影響因素有反應(yīng)物的劑量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)的一致性，因此，嚴(yán)格控制3種因素非常必要。測(cè)定洋蔥多糖的含量時(shí)，應(yīng)將試管傾斜，緩慢加入濃硫酸，待全部加入后，應(yīng)充分震蕩使其完全反應(yīng)，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。

3.3 樣品前處理

在提取得到洋蔥多糖的同時(shí)，里面摻雜的蛋白雜質(zhì)也較多，致使多糖的純度不高，會(huì)直接影響含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，加樣回收率過(guò)高，故本研究采用了有機(jī)試劑法去除蛋白質(zhì)而保留多糖［12-14］。

綜上所述，優(yōu)化后的熱水提醇沉法多糖提取率高且含量也很高，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量操作簡(jiǎn)便，容易實(shí)施，重復(fù)性好，可作為洋蔥多糖的含量測(cè)定方法。