牟燕飛 ，穆小松 ，唐顯軍 ，楊 燕 ，胡 敏

（1.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院·重慶市腫瘤研究所·重慶市腫瘤醫(yī)院，重慶 400030； 2.中國(guó)人民解放軍第三二四醫(yī)院，重慶 400020）

重癥急性胰腺炎（SAP）屬急性胰腺炎（AP）的特殊類型，占AP的10% ～20%，具有病情發(fā)展迅速、并發(fā)癥多、病死率高的特點(diǎn)，其發(fā)生、發(fā)展與抗炎因子、促炎因子、蛋白酶及蛋白酶抑制劑、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)［1-2］。李聃等［3］研究發(fā)現(xiàn)，AP患者的胃腸道、血清中存在的大量炎性介質(zhì)，參與了SAP發(fā)生與演變的整個(gè)過程，并可使單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞過度激活，從而引起體內(nèi)廢物、毒物代謝異常，導(dǎo)致腎臟損傷和加重微循環(huán)障礙。因此，改善微循環(huán)和抑制炎性介質(zhì)的釋放對(duì)SAP至關(guān)重要。目前很多學(xué)者提出，川芎嗪具有鈣通道阻滯劑的作用，可有效阻滯細(xì)胞外鈣內(nèi)流，抑制炎性介質(zhì)釋放，改善細(xì)胞凋亡與微循環(huán)障礙［4］?；诖?，本研究中將川芎嗪用于SAP模型大鼠的治療中，以觀察川芎嗪能否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎性介質(zhì)的釋放而防治大鼠SAP導(dǎo)致的腎損傷?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

84只健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～260 g（四川省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）。7170A型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上海醫(yī)療儀器設(shè)備廠）。川芎嗪注射液（遂成藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20043412，規(guī)格為每支2 mL∶40 mg）；?；悄懰徕c（上海研生實(shí)業(yè)有限公司）；原位細(xì)胞凋亡、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素 10（IL-10）、腫瘤壞死因子 - α（TNF-α）等試劑盒均購(gòu)自上海心語生物科技有限公司。

1.2 方法

將84只大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、SAP組、川芎嗪組，各28只。所有大鼠均禁食但不禁飲 12 h，后用2.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。對(duì)照組開腹后翻動(dòng)胰腺，即縫合關(guān)閉腹腔。SAP組大鼠上腹正中切口進(jìn)腹，提起胃、十二指腸，找到胰管開口，于開口下15 mm處切開十二指腸，并置入無菌塑料管；分別結(jié)扎胰管開口遠(yuǎn)端、近端，以形成20 mm左右的十二指腸閉袢；向閉袢內(nèi)注入5%?；悄懰徕c0.3 mL，使整個(gè)胰腺均勻隆起后退出針頭；5～10 min見胰腺出現(xiàn)肉眼可見的水腫出血，則表示SAP動(dòng)物模型建模成功，隨即縫合關(guān)閉腹腔。川芎嗪組在動(dòng)物模型制作成功后，立即給予0.6%川芎嗪注射液，腹腔注射，用量為每100 g體質(zhì)量1 mL。對(duì)照組、SAP組給予等量生理鹽水腹腔注射。

于術(shù)后6，12，24，48 h相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每組各隨機(jī)選取5只大鼠處死，開腹觀察胰腺和腎臟形態(tài)，吸取腹腔積液并計(jì)量，觀察其顏色與渾濁度。取胰腺組織以10%福爾馬林溶液固定，行蘇木素-伊紅（HE）染色。取左腎組織迅速置液氮中，-80℃保存。經(jīng)心臟穿刺采血4 mL，室溫下靜置30 min凝固后，4℃下以3 000 r／min的速率離心10 min，-20℃保存。

1.3 觀察指標(biāo)

測(cè)定不同時(shí)間的腹腔積液量；胰腺組織病理評(píng)分：將經(jīng)福爾馬林溶液固定的胰腺組織按常規(guī)流程進(jìn)行石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察，并根據(jù)Kusske法［5］進(jìn)行病理評(píng)分；炎性介質(zhì)：將-20℃保存的標(biāo)本于室溫復(fù)融，根據(jù)IL-6，IL-10，TNF-α試劑盒說明分別配置標(biāo)準(zhǔn)品，再使用DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)；腎損傷相關(guān)指標(biāo)：取500 μL血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)淀粉酶、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）；腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)：參照原位細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，顯色使用DAB試劑盒進(jìn)行。在光鏡下，腎臟細(xì)胞核中有棕黃色顆粒即為陽性細(xì)胞，在陽性表達(dá)分布區(qū)域、200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)無重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）為凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)初步以 EpiData 3.1軟件校正，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以±s表示，行 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表5。

3 討論

SAP的發(fā)展常累及機(jī)體多個(gè)重要臟器，并伴大量炎性介質(zhì)的釋放，可在較短時(shí)間內(nèi)引發(fā)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使腎臟無法正常代謝機(jī)體廢物、毒物，最終導(dǎo)致全身性炎性反應(yīng)綜合征，甚至死亡［6］。本研究結(jié)果顯示，3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的腹腔積液量?jī)蓛杀容^有明顯差異（P＜0.05），表明川芎嗪能有效控制SAP的發(fā)展，減輕胰腺組織的進(jìn)一步損傷。川芎嗪是從川芎中提取的吡嗪生物堿，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張小動(dòng)脈、改善微循環(huán)等作用，對(duì)促進(jìn)炎性介質(zhì)代謝、抑制炎性細(xì)胞因子的釋放有重要價(jià)值［7］。本研究結(jié)果顯示，SAP組與川芎嗪組術(shù)后6，12，24 h的水腫、炎癥、出血、壞死評(píng)分比較無明顯差異（P＞0.05），但川芎嗪組術(shù)后48 h的評(píng)分均明顯低于 SAP 組（P＜0.05），且川芎嗪組與對(duì)照組術(shù)后 6，12，24，48 h的 IL-6 比較無明顯差異（P＞0.05），表明川芎嗪在抑制巨噬細(xì)胞釋放炎性因子，降低SAP大鼠炎癥水平的同時(shí)，也可減輕胰腺病理性改變，從而提高SAP的治療效果，這與母?jìng)髻t等［8］的研究結(jié)論相似。

表1 3組大鼠胰腺組織病理評(píng)分、炎性介質(zhì)及腎損傷相關(guān)指標(biāo)比較（±s，n＝5）

表1 3組大鼠胰腺組織病理評(píng)分、炎性介質(zhì)及腎損傷相關(guān)指標(biāo)比較（±s，n＝5）

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，aP＜0.05；與川芎嗪組同時(shí)點(diǎn)比較，bP＜0.05。下表同。

胰腺組織病理評(píng)分（分） 炎性介質(zhì)（pg／mL） 腎損傷相關(guān)指標(biāo)組別出血 壞死對(duì)照組 術(shù)后6 h術(shù)后12 h術(shù)后24 h術(shù)后48 h SAP組 術(shù)后6 h術(shù)后12 h術(shù)后24 h術(shù)后48 h川芎嗪組 術(shù)后6 h術(shù)后12 h術(shù)后24 h術(shù)后48 h 2.63 0 0 0 0 ±0.83a 2.77 ±0.95a 3.29±1.03a 4.35 ±1.16ab 2.54 ±0.62a 2.76±0.73a 2.93 ±0.70a 3.11±0.93a水腫0 0.34 ±0.09 0.41 ±0.10 0.46±0.07 2.85 ±0.74a 3.03 ±0.88a 3.45±1.01a 4.62 ±1.10ab 2.61 ±0.69a 2.83±0.72a 2.95 ±0.79a 3.09±0.95a炎癥0 0.15 ±0.05 0.23 ±0.08 0.34±0.06 2.61 ±0.82a 3.34 ±0.96a 3.57±1.06a 4.46 ±1.13ab 2.46 ±0.75a 2.60±0.76a 2.75 ±0.84a 2.89±0.86a 0 0 0 0 2.66 ±0.87a 2.94 ±0.93a 3.25±1.04a 4.87 ±1.17ab 2.63 ±0.65a 2.79±0.81a 2.90 ±0.78a 3.02±1.01a IL-6 27.65±4.75 36.14 ±4.84 41.52±5.01 52.29 ±5.20 39.36 ±5.68a 46.48±7.21a 65.42 ±7.85ab 84.29 ±8.16ab 31.95±4.73 37.83 ±4.98 43.85 ±6.51 57.18 ±7.10 IL-10 108.15±3.84 113.48 ±4.06 125.72±4.11 134.31 ±4.33 902.33 ±43.71ab 1 010.83±78.96ab 1 325.45 ±84.14ab 1 742.89 ±90.86ab 683.52±40.68a 815.64 ±60.26a 1 013.55 ±71.15a 1 340.86 ±80.32a TNF-α 34.37±4.25 41.12 ±3.92 48.25±4.14 53.27 ±4.27 48.67 ±6.65ab 60.73±5.81ab 78.93 ±6.78ab 103.12 ±8.01ab 38.46±4.87 45.84 ±4.93 53.85 ±6.04 84.87 ±7.17a淀粉酶（U ／L）1 127.85 ±94.78 1 185.64 ±101.82 1 211.63 ±105.60 1 252.23±106.75 3 239.76 ±275.20ab 5 546.82 ±317.28ab 7 766.58±487.92ab 9 785.49 ±568.66ab 2 131.95 ±294.63a 4 237.38±304.65a 5 748.74 ±376.48a 6 587.89±457.17a BUN（mmol／L）3.43 ±1.02 4.32 ±1.01 5.11 ±1.08 5.83±1.04 5.33 ±0.97a 9.16 ±1.36a 15.47±2.14ab 25.39 ±3.87ab 4.02 ±1.12 7.69±1.31a 10.55 ±2.15a 14.78±3.27a Cr（μmol／L）35.34 ±5.21 38.54 ±6.29 42.19 ±6.54 46.28 ±4.69 50.71 ±6.95a 72.43 ±7.31ab 106.29 ±16.12ab 195.52 ±30.91ab 42.16 ±5.87 55.67 ±6.53a 89.39 ±8.04a 124.37 ±12.72a

表2 3組大鼠不同時(shí)間腹腔積液量比較（±s，mL，n ＝5）

表2 3組大鼠不同時(shí)間腹腔積液量比較（±s，mL，n ＝5）

組別對(duì)照組SAP組川芎嗪組術(shù)后6 h 0 3.45 ±1.09ab 2.03 ±0.92a術(shù)后12 h 0 3.96 ±1.12ab 2.24 ±0.96a術(shù)后24 h 0 4.21 ±1.05ab 2.46 ±1.01a術(shù)后48 h 0.51 ± 0.19 4.68 ± 1.07ab 2.72 ± 1.03a

表3 3組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s，%，n＝5）

表3 3組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s，%，n＝5）

組別對(duì)照組SAP組川芎嗪組1.19 ± 0.42 5.36 ± 1.12ab 3.73 ± 0.94a 1.31 ± 0.44 10.06 ± 1.15ab 6.44 ± 0.98a 1.38 ± 0.46 14.16 ± 1.79ab 9.04 ± 1.81a 1.43 ±0.40 18.09 ±2.17ab 11.52 ± 2.13a術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h

SAP腎損傷是導(dǎo)致SAP患者死亡的主要因素。本研究中通過對(duì)血清淀粉酶、BUN、Cr的分析可知，SAP大鼠均存在不同程度的腎臟損傷，且隨著時(shí)間的推移不斷加重。這不僅促使微循環(huán)阻力增大，血液瘀滯，也會(huì)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化作用，刺激中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮而出現(xiàn)顆粒狀脫落，進(jìn)而促進(jìn)自由基生成及IL-10，TNF-α等炎性介質(zhì)釋放；并加重局部組織損傷，增加毛細(xì)血管通透性，導(dǎo)致血流灌注下降，組織缺氧壞死［9-10］。因此，借助川芎嗪的作用機(jī)制降低大鼠炎性介質(zhì)水平，能緩解大鼠的腎損傷，使血清淀粉酶及BUN、Cr顯著下降［11］。腎臟損傷與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)，若細(xì)胞被廣泛破壞，細(xì)胞膜磷脂將過度氧化，酶、蛋白質(zhì)、核酸等隨之變性，致機(jī)體處于嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)［12］。廖雯靚［13］指出，腎小管上皮細(xì)胞與急性腎衰竭早期就可出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，故調(diào)控細(xì)胞凋亡對(duì)改善SAP預(yù)后，保護(hù)腎臟組織，降低死亡率至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，3組大鼠術(shù)后6，12，24，48 h的腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈增高趨勢(shì)，對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于川芎嗪組和SAP組，且川芎嗪組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較SAP組明顯下降。提示川芎嗪可通過對(duì)抗大鼠體內(nèi)自由基的氧化，改善腎血管灌注，達(dá)到保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞及減少凋亡的目的［14］。

綜上所述，川芎嗪能增加溶酶體膜的穩(wěn)定性，擴(kuò)張腎毛細(xì)血管，增加腎血流量，緩解組織缺血、缺氧狀態(tài)，加快機(jī)體代謝。但AP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種致病因素影響，川芎嗪對(duì)胰腺、腎臟之外的組織器官是否有保護(hù)作用，有待進(jìn)一步研究。