柯 俐，胡小芬，王子龍，曾志將，何旭江

(江西農業(yè)大學蜜蜂研究所,江西南昌330045)

蜜蜂是一種真社會性昆蟲，其獨特的生物學特性受到廣泛關注，是神經生物學、行為學和分子生物學的新興模式生物[1]。蜜蜂的基因轉移及轉基因技術是研究蜜蜂生物學的重要手段。目前，精子介導法[2-4]、電穿孔法[5-6]和基因定點編輯法[7]已在蜜蜂中進行了大量試驗，但均未獲得良好效果。

piggyBac轉座子最早發(fā)現(xiàn)于在鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusiani)中，根據(jù)特征性的TTAA 四核苷酸靶位點在基因組上完成切除與轉座。其與Minos、Hermes和mariner等其它的DNA轉座子不同，piggyBac轉座子家族因特異性識別TTAA序列并可以在基因組上自由移動，又被稱為跳躍基因[8]。目前，piggyBac轉座子在功能基因研究中擁有著強大的優(yōu)勢，具有轉座頻率高、轉座后穩(wěn)定，特別是物種適用性廣泛等優(yōu)點。該技術作為一種良好的外源基因導入手段，在許多鱗翅目和雙翅目昆蟲[9-11]中廣泛應用。

目前，piggyBac在蜜蜂中的應用相對較少。2014年Schulte等[12]首次在蜜蜂中將piggyBac轉座子與轉座酶mRNA共注射，成功將外源性基因植入蜜蜂基因組中，并在子代中檢測到熒光與插入染色體上位置。本研究基于piggyBac轉座子系統(tǒng)，以西方蜜蜂為實驗材料，利用顯微注射技術將外源性Rubia紅色熒光蛋白基因植入西方蜜蜂卵中，并檢測其基因整合與熒光表達情況。該研究可為我國今后的蜜蜂轉基因技術研究和分子育種技術提供科學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗昆蟲

本實驗西方蜜蜂(Apismellifera)選自江西農業(yè)大學蜜蜂研究所實驗蜂場飼養(yǎng)的3群意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)。利用仿生免移蟲王漿生產技術[13]獲取蜂王產卵2 h內受精卵。

1.2 piggyBac質粒與菌株

感受態(tài)細胞Trans5α購自廣州全式金公司，質粒pBac[6×P3-rubia]、質粒pBac Transposase，由德國Martin Beye實驗室饋贈。

1.3 主要試劑藥品

限制性內切酶EcoRI，2 kb、10 kb DNA marker購自大連Takara公司；質粒提取試劑盒Endofree Plasmid Midi Kit 50 preps購于康為世紀生物科技有限公司；OMEGA DNA提取試劑盒購自南昌賽爾生物公司；mMESSAGE mMACHINE?RNA轉錄試劑盒， MEGAclearTM回收試劑盒購自上海拜力生物科技公司。

1.4 顯微注射與實驗室培養(yǎng)

1.4.1 顯微注射針 購自eppendorf公司，直徑2～5 μm，針尖角度37°，長度5.1 cm，密封保存。

1.4.2 注射液體 質粒經質粒提取試劑盒提取，保存于-20 ℃，在注射前取至室溫10 min；轉座酶mRNA經轉錄試劑盒體外轉錄，保存于-80 ℃，在注射前取至室溫10 min待用。

1.4.3 蜜蜂卵的準備 利用仿生免移蟲產卵器[13]控王2 h，獲得約80粒卵供下一步試驗所用。

1.4.4 意蜂卵的顯微注射 將卵與上樣顯微注射針分別調試在倒置顯微鏡視野的中央。轉座子piggyBac質粒的濃度為20 μL/ng。調節(jié)注射壓力在660 hPa,確認出液后備用，調整卵的角度至與針尖70°～90°。令顯微注射針從蜜蜂卵的尾端1/3注入，停留1～2 s，看到蜂卵中出現(xiàn)液滴，移出針端。將注射后受精卵移至35 ℃，相對濕度75%的培養(yǎng)箱內的盒子中培養(yǎng)。

1.4.5 蜜蜂卵的實驗室培養(yǎng) 蜜蜂幼蟲飼料配方參照Vandenberg等[14]的方法，體外培養(yǎng)方法參照王倩等[15]的方法。

1.5 piggyBac質粒的提取與酶切

將菌株擴大培養(yǎng)后按照質粒提取試劑盒說明書提取轉座質粒piggyBac，用限制性內切酶EcoRI進行酶切2 h,接著進行凝膠電泳，紫外成像觀察。

表1 本研究用到的引物

1.6 轉piggyBac蜜蜂的分子生物學方法鑒定

提取蜜蜂基因組總DNA。使用Primer primer 5.0軟件設計引物兩對，并由生工技術有限公司合成，分別為Rubia-F/r陽性引物與EA-piggy-fw/ piggy-out-rev陰性引物。piggyBac轉座子在生物體內會在BacR、BacL兩側進行選擇性剪切形成兩個活性臂，并插入染色體中。陰性引物位于BacR活性臂兩側，該對陰性引物參考自Christina Schulte的文章[12]。目的產物膠回收產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.7 熒光顯微鏡檢測

將蛹期蜜蜂置于QLYMPUS-DP80熒光顯微鏡觀察結果。由于紅色熒光蛋白的6×P3啟動子在神經系統(tǒng)中特異表達，本實驗選擇神經系統(tǒng)較發(fā)達的頭部進行觀察。

1.8 PCR體外擴增與基因序列測序

將顯微注射卵培養(yǎng)至蛹期。當蜜蜂蛹眼睛發(fā)育成熟并未出現(xiàn)顏色時，取其頭部與腹部進行總DNA提取，并用上述引物進行PCR擴增。擴增反應體系為25 μL，其中2×TaqMaster Mix 12.5 μL，2 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，dd H2O補至終體積，94 ℃預變性2 min,30個循環(huán)(94 ℃變性，30 s;56.7 ℃退火,45 s;72 ℃延伸,90 s),72 ℃再延伸10 min。電泳后切膠回收。送至生工生物工程股份有限公司進行基因測序。

2 結果與分析

2.1 轉座質粒連接后構建

連接后的重組質粒長度為8 777 bp，用酶切的方法鑒定piggyBac載體，用EcoRI限制酶酶切后在Marker 3 900 bp和4 800 bp附近或得兩條目的條帶(圖1-A，2泳道)，與預期的剪切結果一致。

A，M:DNA Marker 10 000,1:pBac[6×P3-rubia]質粒；2:EcoRI酶切；B，pBac[6×P3-rubia]重組質粒圖譜，BacR、BacL:piggyBac轉座子的反向末端重復序列，6×P3：6個重復 Pax6 元件基因的核心啟動子；SV40，SV40多聚位點；Am-actin5c啟動子：蜜蜂actin5c基因的上游翻譯起始位點啟動子；rubia：編碼紅色熒光蛋白的報告基因A,M:DNA Marker 10 000;1:pBac[6×P3-rubia] plasmid;2:EcoRI digestion;B,pBac[6×P3-rubia] recombinant plasmid map,BacR,BacL:piggyBac transposon inverted terminal repeats,6 × P3:core promoter of six repeat Pax6 element genes;SV40,SV40 polyadenylation sites;Am-actin5c promoter:upstream translation initiation promoter of honeybee actin5c gene;rubia:reporter genes encoding red and fluorescent proteins圖1 pBac[6×P3-rubia]重組質粒的酶切分析及圖譜Fig.1 Restriction analysis and mapping of recombinant plasmid pBac[6×P3-rubia]

2.2 蜜蜂培養(yǎng)數(shù)據(jù)

顯微注射232粒卵，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中室內培養(yǎng)，平均孵化率達13.4%，成蛹率達7.3%(表2)。

表2 注射轉座子質粒與轉座酶mRNA培養(yǎng)數(shù)據(jù)

M:DL 2000;1:注射piggyBac轉座質粒后意大利蜜蜂DNA引物陽性克隆;2:注射piggyBac轉座質粒后意大利蜜蜂DNA陰性引物對照;3:野生型意大利蜜蜂M:DL 2000;1:Positive clone of Apis mellifera ligustica honeybee DNA primer after piggyBac transposing plasmid injection;2:Apis mellifera ligustica honeybee DNA negative primer control after piggyBac transposing plasmid injection;3:Wild-type Apis mellifera ligustica honeybee DNA圖2 轉座子質粒Rubia基因PCR分析Fig.2 Transposon plasmid Rubia gene PCR analysis

2.3 轉piggyBac蜜蜂表達鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性的Rubia目的產物(圖2)，產物條帶大小與預期目的片段大小基本一致。

2.4 熒光顯微鏡觀察

熒光顯微鏡檢測17只顯微注射蜜蜂蜂蛹，結果表明：顯微注射實驗組蜜蜂頭部的吻與復眼有微弱的紅色熒光信號，而對照組無明顯紅色熒光信號，表明Rubia紅色熒光蛋白可在注射組蜜蜂蛹中進行微量表達(圖3)。

2.5 測序結果

回收產物進行測序，并在NCBI的blast進行比對。結果表明：目的條帶的基因序列與piggyBac轉座子質粒中Rubia基因原始基因序列配比率為81.23%(圖4)，序列基本一致。

A、B分別為注射piggyBac質粒后蜜蜂頭部與野生型蜜蜂頭部對照組的紅色熒光照片A and B indicates the red fluorescence photos of the honeybee head with piggyBac plasmid injection and the wild type bee head control group,respectively圖3 熒光在蜜蜂頭部中的表達觀察Fig.3 Fluorescent expression observation in honeybee

3 討論

本實驗通過在西方蜜蜂早期胚胎卵中注射piggyBac轉座子和轉座酶mRNA，研究了Rubia外源基因在蜜蜂受精卵中的轉移與表達。本研究顯微注射后的平均孵化率達13.4%，成蛹率達7.3%，與前人結果相近[16]。表明顯微注射piggyBac轉座子系統(tǒng)與幼蟲人工體外培養(yǎng)技術具有良好的操作性和成功率。通過熒光顯微鏡觀察，在注射組蜜蜂蛹頭部出現(xiàn)部分紅色熒光信號，而未在對照組發(fā)現(xiàn)信號。同時，PCR擴增也檢測到了蜜蜂頭胸部中外源基因Rubia片段。這一結果表明piggyBac轉座系統(tǒng)可以將紅色熒光蛋白Rubia轉移入蜜蜂DNA，并進行微弱表達。

6×P3啟動子已經成功在黑腹果蠅[17]，赤擬谷盜[18]，異色瓢蟲[19]，蝴蝶[20]等的基因轉移研究中應用，在眼睛以及神經系統(tǒng)發(fā)育過程中至關重要[21]。目前還沒有蜜蜂特異性啟動子的報道。因此本實驗選用6×P3啟動子，但結果基因轉移效率偏低，可能該啟動子在西方蜜蜂細胞中啟動活性較弱有關。另外，不同的啟動子如Am-actin5c,elp2l,Am-hsp83 ,Am-hsp70，6×P3等在不同的時期與組織特異性表達。若能夠選擇構造出西方蜜蜂強表達特異性啟動子，外源基因在西方蜜蜂中的表達將會顯著提高。

熒光蛋白標記技術在分子實驗中應用廣泛。本實驗中選用的是Rubia紅色熒光蛋白，近年來用作果蠅[22]，家蠶[23]，斯氏按蚊[24]等昆蟲轉基因標記中。本實驗中的陽性表達率與前人研究比較接近[25]，

圖4 PCR擴增產物測序與轉座子piggyBac中Rubia基因序列比對結果Fig.4 Comparison of PCR amplification products Sequencing and Rubia gene sequences in piggyBac transposon

但熒光表達比較弱。這可能與顯微注射過程中轉座事件的發(fā)生概率較低有關。此外，蜜蜂受精卵從蜂王生殖腺脫離后就開始快速激烈的卵裂、活化和分化等不同發(fā)育過程[26]。本研究選取蜂王產卵2 h內的受精卵進行顯微注射，可能受精卵已處于卵裂和分化等胚胎發(fā)育過程，影響了piggyBac轉座系統(tǒng)的基因轉移效率。實驗組中幼蟲的成活率比自然蜂群低，且孵化時間會延長。可能注射過程對受精卵有損傷效應，且外源基因Rubia對蜜蜂卵的孵化和幼蟲發(fā)育也會造成一定影響。

蜜蜂是真社會昆蟲，也是重要的經濟昆蟲。其社會分工、級型分化、單雙倍體性別決定機制和工蜂監(jiān)督等的生物學特性受到了廣泛關注。piggyBac轉座技術在蜜蜂獨特生物學的研究中具有良好的應用前景，也為蜜蜂分子育種提供了良好的技術手段。本研究利用piggyBac轉座系統(tǒng)成功將Rubia蛋白成功轉移至蜜蜂受精卵中。雖然轉移效率偏低，且僅形成了嵌合體蜜蜂個體，但隨著該技術不斷的改進與突破，必將廣泛應用到在今后的蜜蜂分子生物學研究與分子育種生產實踐中。