杜偉，郭麗娜，龐席寧

(1 遼寧中置盛京老年病醫(yī)院，沈陽(yáng) 110000；2 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院；3 沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院渾南分院)

肺纖維化是由多種病因引起的纖維增殖性疾病，其主要特征包括成纖維細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，最終會(huì)導(dǎo)致不可逆肺組織結(jié)構(gòu)破壞和肺功能喪失[1]。目前對(duì)肺纖維化仍缺乏理想的治療手段，西醫(yī)治療以糖皮質(zhì)激素為主，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。中醫(yī)治療則主要采用辯證療法，但總體來(lái)看其治療效果仍然有限。因此，深入探討發(fā)病機(jī)制尋找有效的作用靶點(diǎn)對(duì)于肺纖維化的治療具有重要意義。miRNA是一類長(zhǎng)度在19～25 bp的內(nèi)源單鏈RNA分子，能夠通過(guò)對(duì)其下游靶基因的調(diào)控參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括肺纖維化[2,3]。Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比,在肺纖維化組織以及博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中miR-215-5p表達(dá)均明顯升高，然而miR-215-5p是否與肺纖維化的發(fā)生有關(guān)以及其如何參與肺纖維化的進(jìn)展仍未明確。2016年10月～2018年3月，本研究采用TGF-β處理體外培養(yǎng)的人肺成纖維細(xì)胞，在體外模擬肺纖維化的發(fā)病過(guò)程，觀察下調(diào)miR-215-5p對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞IMR-90增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：人肺成纖維細(xì)胞系IMR-90購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。主要試劑：EMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；陰性對(duì)照(NC)inhibitor以及miR-215-5p inhibitor購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT試劑以及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；cyclinD1抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；α-SMA抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；RB1抗體購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。RNA提取試劑盒以及SYBER green master mix購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) IMR-90細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的EMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天傳代1次，取第12～20代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 TGF-β處理與下調(diào)miR-215-5p方法 將IMR-90細(xì)胞按照3×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種至6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用終濃度為50 nmol/L的miR-215-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、TGF-β組、TGF-β+NC inhibitor組、TGF-β+miR-215-5p inhibitor組。對(duì)照組正常培養(yǎng)；TGF-β組參考文獻(xiàn)[5]，采用10 ng/mL的TGF-β處理；TGF-β+NC inhibitor組采用陰性對(duì)照inhibitor轉(zhuǎn)染24 h后采用10 ng/mL的TGF-β處理；TGF-β+miR-215-5p inhibitor組采用miR-215-5p inhibitor轉(zhuǎn)染24 h后采用10 ng/mL的TGF-β處理。

1.4 細(xì)胞增殖情況觀察 細(xì)胞分組及處理同1.3。按照3×103/孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至96孔板，在各組處理結(jié)束前4 h加入0.5 mg/mL的MTT試劑。分別在NC inhibitor或者miR-215-5p inhibitor轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h吸除上清液，加入100 μL的DMSO溶解細(xì)胞生成的結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上測(cè)量各組在570 nm波長(zhǎng)處的光密度值，以此代表各組細(xì)胞的增殖情況。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞分組及處理同1.3。于NC inhibitor或者miR-215-5p inhibitor轉(zhuǎn)染48 h，350 g離心5 min收集各組細(xì)胞，洗滌后吸除上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，將細(xì)胞置于4 ℃固定3 h。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入25 μL的碘化丙啶染色液，將細(xì)胞置于37 ℃避光孵育45 min。染色結(jié)束后采用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞周期變化情況。

1.6 細(xì)胞cyclinD1、RB1和α-SMA mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。采用試劑盒提取細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在PCR反應(yīng)管中加入1 μL 10倍稀釋的cDNA模板，上下游引物各0.5 μL，SYBER green master mix 10 μL，用雙蒸水補(bǔ)足總反應(yīng)體積至20 μL。然后將反應(yīng)管置于ExicyclerTM96 PCR儀上進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中用到的引物序列如下：cyclinD1正向引物為5′-AAACAGATCATCCGCAAACAC-3′，反向引物為5′-GTTGGGGCTCCTCAGGTTC-3′；α-SMA正向引物為5′-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3′，反向引物為5′-AGATGGGGACATTGTGGGT-3′；RB1正向引物為5′-GGGTGATTCCTAAGCCACTTG-3′，反向引物為5′-TGGGTTATCAGGACTCCCACTC-3′；GAPDH正向引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min；4 ℃ 5 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞cyclinD1、RB1和α-SMA蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，采用RIPA裂解液裂解，離心收集總蛋白，采用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。100 ℃煮沸5 min將蛋白變性后，取30 μg變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白電泳產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用5%脫脂奶粉封閉蛋白后采用TTBS洗膜3次，在雜交袋中分別加入稀釋一抗(cyclinD1 1∶5 000倍稀釋；α-SMA 1∶5 000倍稀釋；RB1 1∶1 000倍稀釋；GAPDH 1∶1 000倍稀釋)，于4 ℃孵育過(guò)夜。TTBS洗膜后加入1∶10 000倍稀釋的二抗，于37 ℃孵育1 h。采用ECL試劑盒曝光膠片，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 各組細(xì)胞增殖能力比較見(jiàn)表1。從轉(zhuǎn)染48 h開始，TGF-β組細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組(P均<0.05)；與TGF-β組相比，TGF-β+NC inhibitor組細(xì)胞增殖能力沒(méi)有明顯變化(P均>0.05)；然而與TGF-β+NC inhibitor組相比，TGF-β+miR-215-5p inhibitor組細(xì)胞增殖能力降低(P均<0.05)。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與TGF-β+NC inhibitor組相比，bP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞周期變化情況比較 與對(duì)照組相比，TGF-β組G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高(P均<0.05)。與TGF組相比，TGF-β+NC inhibitor組各個(gè)時(shí)期細(xì)胞比例均未發(fā)生變化(P均>0.05)。與TGF-β+NC inhibitor組相比，TGF-β+miR-215-5p inhibitor組G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞周期變化情況比較

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與TGF-β+NC inhibitor組相比，bP<0.05。

2.3 各組cyclinD1、RB1和α-SMA表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，TGF-β組cyclinD1、α-SMA表達(dá)升高，RB1表達(dá)降低(P均<0.05)。與TGF-β組相比，TGF-β+NC inhibitor組cyclinD1、RB1和α-SMA均未發(fā)生明顯變化(P均>0.05)。與TGF-β+NC inhibitor組相比，TGF-β+miR-215-5p inhibitor組cyclinD1、α-SMA的表達(dá)下調(diào)，RB1表達(dá)升高(P均<0.05)。

3 討論

肺纖維化過(guò)程中巨噬細(xì)胞及損傷的上皮細(xì)胞會(huì)釋放大量的細(xì)胞因子,如TGF-β、IGF-1、PDGF等，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖分化，誘導(dǎo)膠原的大量生成進(jìn)而引發(fā)不可逆的肺部損傷[6,7]。其中，TGF-β是作用最強(qiáng)的致纖維化因子[8,9]。在TGF-β作用下肺成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞異常增生是肺纖維化的重要機(jī)制之一[10]。

表3 各組細(xì)胞cyclinD1、RB1和α-SMA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與TGF-β+NC inhibitor組相比，bP<0.05。

本研究采用TGF-β處理肺成纖維細(xì)胞，在體外模擬了肺纖維化過(guò)程，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比TGF-β組肺成纖維細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，表明在TGF-β的作用下肺成纖維細(xì)胞發(fā)生了類似肺纖維化損傷，與前人研究[5]結(jié)論一致。而與TGF-β組相比，TGF-β+NC inhibitor組細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化，表明轉(zhuǎn)染NC inhibitor未影響肺成纖維細(xì)胞的增殖能力。而與TGF-β+NC inhibitor組相比TGF-β+miR-215-5p inhibitor組細(xì)胞增殖能力降低，說(shuō)明下調(diào)miR-215-5p能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖。

細(xì)胞的增殖周期有G1/S和G2/M兩個(gè)關(guān)鍵性限制點(diǎn)，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1是細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)的重要調(diào)節(jié)蛋白[11]。在胃癌細(xì)胞中上調(diào)miR-215-5p能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)cyclinD1的表達(dá)并增加S期細(xì)胞的比例;相反，抑制miR-215-5p則能夠顯著降低cyclinD1表達(dá)并阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)展[12]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β組肺成纖維細(xì)胞G1期比例降低，S期比例升高，同時(shí)cyclinD1表達(dá)升高，表明TGF-β促進(jìn)了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。而與TGF-β組相比，TGF-β+ NC inhibitor組細(xì)胞周期未發(fā)生顯著變化，cyclinD1表達(dá)不變，表明轉(zhuǎn)染NC inhibitor不影響細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。與TGF-β+NC inhibitor組相比，TGF-β+miR-215-5p inhibitor組G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低，cyclinD1表達(dá)降低，該結(jié)果提示下調(diào)miR-215-5p能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。我們的結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

RB1是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，該基因因?yàn)榕c視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)而得名。RB1能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，維持細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的平衡[13]。在細(xì)胞內(nèi)，RB1通過(guò)與E2F結(jié)合而抑制E2F的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期由G1期向S期的轉(zhuǎn)化。抑制RB1的活性會(huì)促使細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[14]。Deng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-215-5p能夠結(jié)合于RB1的3′-UTR，抑制RB1的表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的周期轉(zhuǎn)換以及細(xì)胞增殖。我們的研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β組RB1的表達(dá)顯著降低，與TGF-β組相比TGF-β+ NC inhibitor組細(xì)胞RB1的表達(dá)未發(fā)生顯著變化，表明轉(zhuǎn)染NC inhibitor不影響細(xì)胞RB1的表達(dá)水平。與TGF-β+NC inhibitor組相比，TGF-β+miR-215-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)RB1表達(dá)顯著降低，表明下調(diào)miR-215-5p能夠促進(jìn)RB1的表達(dá)。我們推測(cè)其原因可能是由于下調(diào)miR-215-5p阻礙了miR-215-5p對(duì)RB1的靶向抑制作用，進(jìn)而延緩了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。

α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，當(dāng)肺部受損后肺成纖維細(xì)胞會(huì)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而過(guò)多的肌成纖維細(xì)胞會(huì)引起肺組織過(guò)度收縮，順應(yīng)性下降以及膠原的形成，最終導(dǎo)致纖維化[16,17]。在多種因素導(dǎo)致的肺纖維化過(guò)程中均能夠檢測(cè)到α-SMA的升高[18,19]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β組α-SMA表達(dá)顯著升高，表明TGF-β在體外引發(fā)了肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。與TGF-β組相比，TGF-β+NC inhibitor組α-SMA未發(fā)生明顯變化，表明轉(zhuǎn)染NC inhibitor不影響細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)。然而與TGF-β+NC inhibitor組相比，TGF-β+miR-215-5p inhibitor組α-SMA的表達(dá)顯著降低，表明下調(diào)miR-215-5p能夠通過(guò)阻礙肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而緩解肺纖維化。Freytsis等[20]研究同樣發(fā)現(xiàn)，RB1基因敲除小鼠的主動(dòng)脈瓣組織中α-SMA的表達(dá)顯著下降，然而其機(jī)制仍不明確。我們將在未來(lái)的研究中進(jìn)一步探討其具體機(jī)制。

綜上可見(jiàn)，下調(diào)miR-215-5p能夠抑制RB1表達(dá)進(jìn)而下調(diào)cyclinD1，阻礙TGF-β誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的周期轉(zhuǎn)換進(jìn)而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖；同時(shí)，下調(diào)miR-215-5p也能夠抑制α-SMA的表達(dá)阻礙TGF-β誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。抑制miR-215-5p具有緩解肺纖維化的潛力，miR-215-5p可以作為肺纖維化的治療靶點(diǎn)。