金大玉 印有亮

山莨菪堿作為毒蕈堿型(M型)乙酰膽堿受體競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑除M受體阻斷作用外尚有許多其他重要的治療作用，它可通過多種途徑調(diào)節(jié)微循環(huán)和發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療休克、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病等，但是山莨菪堿在治療內(nèi)耳疾病方面的研究不多，僅有一些關(guān)于噪聲性聾[1,2]、梅尼埃病和突發(fā)性聾等疾病的臨床應(yīng)用報(bào)道，在對(duì)耳蝸輻射損傷保護(hù)作用方面尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在通過電鏡觀察應(yīng)用山莨菪堿后豚鼠耳顳部電離輻射后耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)變化，探討山莨菪堿對(duì)耳蝸放射損傷的保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 采用耳廓反應(yīng)靈敏的健康豚鼠25只，隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組5只，觀察雙耳共10耳；單放組10只，觀察左耳共10耳；防護(hù)組10只，觀察左耳共10耳。每次放射前30分鐘，防護(hù)組按20 mg/kg體重股部肌肉注射山莨菪堿，對(duì)照組和單放組注射等量生理鹽水。

1.2電離輻射方法 單放組及防護(hù)組豚鼠不麻醉，用熱塑面膜固定，專用X線模擬定位機(jī)定位；暴露頭部，用醫(yī)用直線加速器所產(chǎn)生的6 MeV電子線進(jìn)行分次照射，每次2 Gy,每周5次，共30次，累計(jì)劑量60 Gy。對(duì)照組不預(yù)照射。

1.3掃描電鏡標(biāo)本制備及觀察 各組選擇8耳，進(jìn)行2.5%戊二醛活體心臟灌注，灌流固定后，去除前庭膜，盡可能地暴露螺旋器。在解剖顯微鏡下定位，將要觀察的部分面朝上，用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上。然后進(jìn)行鍍膜，隨即在日立S—450型掃描電鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.4透射電鏡標(biāo)本制備及觀察 各組隨機(jī)選擇2耳，進(jìn)行2.5%戊二醛活體心臟灌注，灌流固定后，在解剖顯微鏡下取出基底膜，繼續(xù)進(jìn)行梯度乙醇脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切半薄切片、染色定位、制刀和制備水槽、制備支持膜網(wǎng)、超薄切片、染色過程后，最后用透射電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1一般狀態(tài)觀察 各組豚鼠在放射中及放射后均無頭部偏斜及行走時(shí)傾倒趨勢(shì)，飲食可，無明顯消瘦，無死亡。

2.2透射電鏡觀察結(jié)果 正常對(duì)照組耳蝸外毛細(xì)胞邊界清楚，細(xì)胞無腫脹，表皮板完整，線粒體嵴完整，核膜完整(圖1)。單放組耳蝸的外毛細(xì)胞邊界不清，細(xì)胞腫脹變形；表皮板疏松、不規(guī)則、局部變?。痪€粒體空泡變，線粒體嵴斷裂；胞漿內(nèi)可見許多無結(jié)構(gòu)區(qū)；核膜不完整，異染色質(zhì)增多(圖2)。防護(hù)組耳蝸外毛細(xì)胞邊界較清，細(xì)胞略腫脹；表皮板完整，線粒體嵴較完整，核膜較完整(圖3)。

2.3掃描電鏡觀察結(jié)果 對(duì)照組耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛排列呈V字形，纖毛排列整齊，靜纖毛僵直度正常(圖4)。單放組耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛排列失去其正常的V字形，纖毛明顯融合、倒伏、缺失、排列紊亂，表皮板軟化、塌陷(圖5)。防護(hù)組耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛僵直度正常，排列基本整齊，偶見倒伏現(xiàn)象(圖6)。

圖1 對(duì)照組透射電鏡觀察 外毛細(xì)胞邊界清楚,細(xì)胞無腫脹;表皮板完整;線粒體嵴完整;核膜完整(×2 000倍) 圖2 單放組透射電鏡觀察 外毛細(xì)胞邊界不清,細(xì)胞腫脹變形;表皮板疏松、不規(guī)則、局部變薄;線粒體空泡變,線粒體嵴斷裂;胞漿內(nèi)可見許多無結(jié)構(gòu)區(qū);核膜不完整,異染色質(zhì)增多(×2 000倍) 圖3 防護(hù)組透射電鏡觀察 外毛細(xì)胞邊界較清,細(xì)胞略腫脹;表皮板完整;線粒體嵴較完整;核膜較完整(×2 000倍)

圖4 對(duì)照組掃描電鏡 外毛細(xì)胞靜纖毛排列呈V字形,纖毛排列整齊,靜纖毛僵直度正常(×2 000倍) 圖5 單放組掃描電鏡 外毛細(xì)胞靜纖毛排列失去正常的V字形,纖毛明顯融合、倒伏、缺失、排列紊亂,表皮板軟化、塌陷(×2 000倍) 圖6 防護(hù)組掃描電鏡 外毛細(xì)胞靜纖毛僵直度正常,排列基本整齊,偶見倒伏現(xiàn)象(×2 000倍)

3 討論

山莨菪堿對(duì)耳蝸輻射損傷防護(hù)的機(jī)制可能與其通過多種途徑調(diào)節(jié)內(nèi)耳微循環(huán)及其細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。電離輻射對(duì)耳蝸的損傷，一方面是直接作用于感覺細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜等，發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而產(chǎn)生一系列的自由基反應(yīng)，損傷毛細(xì)胞。對(duì)山莨菪堿抗氧化機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，它對(duì)次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有顯著劑量依賴性清除作用[3]，因此可通過抗氧化作用減少自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞的作用。電離輻射對(duì)耳蝸損傷的另一機(jī)制可能是輻射引起血管紋及其中微小血管的損傷[4]，導(dǎo)致血-迷路屏障的形態(tài)結(jié)構(gòu)損害[5]，而造成內(nèi)耳微循環(huán)障礙。山莨菪堿可抑制血栓烷A2的合成，抑制血小板及粒細(xì)胞的聚集，增強(qiáng)微血管的自律運(yùn)動(dòng)，使微血管血流速度加快和血流量增加；實(shí)驗(yàn)證明它可以明顯降低紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物的量，增加紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使紅細(xì)胞的變形能力增強(qiáng)，從而改善血流變學(xué)的特性[6]；山莨菪堿除可通過神經(jīng)調(diào)節(jié)阻斷M受體對(duì)抗兒茶酚胺引起的血管痙攣外，還可通過促進(jìn)一氧化氮合酶活性，催化L精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐谎趸?，后者彌散或載體轉(zhuǎn)運(yùn)至血管平滑肌，激活胞酶，使內(nèi)鳥苷酸環(huán)化cGMP升高而擴(kuò)張血管[7]。山莨菪堿通過上述多種途徑，改善內(nèi)耳微循環(huán)，從而發(fā)揮其對(duì)內(nèi)耳輻射損傷的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡和透射電鏡觀察結(jié)果示，單放組耳蝸外毛細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)，而放射前注射山莨菪堿的防護(hù)組耳蝸外毛細(xì)胞基本正常，證實(shí)山莨菪堿對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞具有明顯的防護(hù)作用。