/林珊珊 汪琪璇摘譯 黃治物審校/ 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院聽力與言語康復(fù)系(杭州 30053)； 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所，上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

采用單細(xì)胞RNA測序的方法，Shrestha及其同事發(fā)現(xiàn)(圖1)：①內(nèi)耳I型螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元可分為三種亞型；②各個(gè)亞型之間以及頻率響應(yīng)軸不同區(qū)域的分子表達(dá)存在顯著差異；③各個(gè)亞型的分化從出生后開始，依賴正常內(nèi)毛細(xì)胞活動(dòng)的誘導(dǎo)。

圖1 單細(xì)胞測序?qū)型SGN分為三種亞型

1 介紹

神經(jīng)系統(tǒng)具有異質(zhì)性的特征，通?？筛鶕?jù)神經(jīng)元的位置、功能和形態(tài)等來區(qū)分不同類型的神經(jīng)元，它們構(gòu)成特定功能的神經(jīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)中，I型螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons, SGNs)是與內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cells, IHCs)相連的雙極細(xì)胞，具有聲音編碼能力，能夠?qū)?fù)雜的聲學(xué)信息傳遞到聽覺腦干。早在50年前，就有學(xué)者通過貓聽神經(jīng)中的單纖維記錄發(fā)現(xiàn)I型SGNs對聲音的敏感性和自發(fā)放電率(spontaneous firing rate, SR)不同，Liberman等學(xué)者根據(jù)神經(jīng)興奮性閾值與SR之間的關(guān)系，將它們分為三組：低SR、中SR和高SR的I型SGNs，三種類型的SGNs分別沿IHCs胞底外側(cè)的不同位置形成突觸，并投射到腦干內(nèi)的不同細(xì)胞。這種微觀結(jié)構(gòu)和電生理特征的異質(zhì)性使耳蝸能夠編碼寬范圍的聲音強(qiáng)度，并有助于維持嘈雜環(huán)境下的聽力，但其本質(zhì)和根源尚不清楚。

事實(shí)上，已有研究提示SGNs可能存在分子異質(zhì)性，不同類型的SGNs可能表達(dá)不同的受體和離子通道。然而對于形態(tài)、位置、功能相似的各亞型SGNs，尚缺乏對亞型特異分子標(biāo)志的認(rèn)知，限制了我們對各亞型的功能及其潛在選擇易感性的研究。因此，想要明晰SGNs主動(dòng)調(diào)節(jié)聽覺信號(hào)編碼的方式，必須全面認(rèn)識(shí)其分子圖譜。

在最近的一項(xiàng)研究中，Shrestha、Liberman 等學(xué)者首次對內(nèi)耳SGNs采用基于高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的方法(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)來研究I型SGNs的亞型分類及其相關(guān)特性。該研究發(fā)現(xiàn)了三種分子表達(dá)特征截然不同的亞型(Ia、Ib和Ic)，分別與高、中、低SR的SGNs的解剖學(xué)位置對應(yīng)匹配，且其沿著內(nèi)耳基底膜頻率響應(yīng)軸的分布存在差異。他們還發(fā)現(xiàn)，I型SGNs的分型是隨聽覺發(fā)育逐漸形成的，其分化需要IHCs活動(dòng)的促進(jìn)。這項(xiàng)對SGNs異質(zhì)性的通觀揭示了直接影響聽覺信息編碼的內(nèi)源性差異，強(qiáng)調(diào)了在發(fā)育過程中聽覺活動(dòng)對異質(zhì)性形成的重要性，重點(diǎn)提示了年齡相關(guān)性聽力損失和先天性聽力損失影響SGNs的組成。

2 首次將單細(xì)胞測序用于內(nèi)耳SGNs分子學(xué)研究的成果

2.1細(xì)胞RNA測序明確I型和II型SGNs之間存在明顯分子表達(dá)差異 為了確定采用scRNA-seq 研究SGNs異質(zhì)性方法的準(zhǔn)確性，該研究首先分別收集了P25-P27小鼠耳蝸基底膜底回、中回和頂回的SGNs(共11只小鼠，186個(gè)SGNs)進(jìn)行scRNA-seq，根據(jù)其分子表達(dá)特征，通過t-分布鄰域嵌入算法(t-SNE)將其分為若干不同的細(xì)胞亞群。研究觀察到I型和II型SGNs(二者在解剖學(xué)特征、髓鞘形成和突觸數(shù)目等方面有明顯的差異)被分為兩個(gè)分子表達(dá)各異的亞群，各占實(shí)驗(yàn)樣本的96%和4%，接近組織學(xué)比例，且分別富含已知的I型和II型SGNs分子標(biāo)記Epha4 和Th。采用半定量RNA原位檢測方法RNA scope驗(yàn)證了scRNA-seq檢測到異質(zhì)性是真實(shí)的差異，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組圖譜可用于構(gòu)建SGNs的亞型的分子框架。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)了I型和II型SGNs在1 700余個(gè)基因表達(dá)水平上存在顯著差異(P<0.01)，其中335個(gè)基因表現(xiàn)為二元有/無(定義表達(dá)細(xì)胞>70%為有，表達(dá)細(xì)胞<20% 為無)表達(dá)，表達(dá)譜差異的前50個(gè)基因富集于突觸前囊泡相關(guān)蛋白見圖2。

圖 2 I型和II型SGNs間的差異表達(dá)基因

2.2I型SGNs的三種分子學(xué)亞型 該研究聚焦于表達(dá)Epha4+Th-的I型SGNs，其在t-SNE中顯示為三個(gè)細(xì)胞亞群，與主成分分析、分級(jí)聚類分析法等多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得出的分型一致，提示I型SGNs可分為三種亞型，即Ia、Ib和Ic型，分別占35%、40%和25%。共有425個(gè)基因在Ia、Ib和Ic型 SGNs之間顯著差異表達(dá)(P<0.01)，前100個(gè)基因見圖3。GO分析顯示亞型間差異表達(dá)的基因富集于調(diào)控神經(jīng)元分化、連接和生理功能，如“鉀通道活性”、“鈣離子結(jié)合”、“信號(hào)傳導(dǎo)活性”、“神經(jīng)元分化”、“離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)”和“軸突發(fā)育”等過程，編碼“突觸”、"陽離子通道復(fù)合體"和"質(zhì)膜"蛋白質(zhì)的基因過度表達(dá)，同時(shí)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)差異的組合進(jìn)一步表明I型SGNs各個(gè)亞型內(nèi)不同基因群的表達(dá)可能影響其分化。

由此可見，SGNs各亞型分子表達(dá)特征的差異具有明顯的生理學(xué)意義，一些突觸傳遞、神經(jīng)生理相關(guān)蛋白及其家族蛋白的表達(dá)具有顯著的亞型特異性。例如，Ia、Ib和Ic型SGNs的神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)差異較大，谷氨酸受體亞基Grik4 從Ia到Ic的表達(dá)呈梯度遞增，而代謝型受體亞基Grm8僅在Ic型SGNs中特異性表達(dá)。Ia型SGNs富含膽堿能受體亞基Chrna1和Chrna4，而Ic型SGNs富含多巴胺受體亞基Drd1。在離子通道方面，編碼鉀離子通道亞基的基因中，Kcnq4和Kcnd2主要存在于Ia和Ib型SGNs中，而Ib和Ic型SGNs富含Kcnip2和Kcnj9表達(dá)。Ia型SGNs富含電壓門控鈣離子通道Cacna1b、Cacna1h和Cacna2d1亞基表達(dá)。漏鈉通道Nalcn的表達(dá)局限于Ib和Ic型SGNs，而電壓門控鈉離子通道的Scn2b亞基從Ic到Ia型SGNs的表達(dá)梯度遞減?？傊?，以上發(fā)現(xiàn)表明，三種分子學(xué)定義的I型SGNs亞群構(gòu)成了生理功能不同的亞型。

圖3 Ia、Ib和Ic型SGNs中的差異表達(dá)的部分基因

2.3I型SGNs的頻率響應(yīng)區(qū)差異性 為進(jìn)一步研究I型SGNs異質(zhì)性的來源，該研究分別對耳蝸底回、中回和頂回三個(gè)區(qū)域的SGNs進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)存在頻率響應(yīng)區(qū)域的差異性。三個(gè)區(qū)域的I型SGNs間存在114個(gè)差異表達(dá)的基因，而不同亞型之間有425個(gè)基因差異表達(dá)。與驅(qū)動(dòng)Ia、Ib和Ic分型的基因不同，區(qū)域富集的基因主要呈梯度表達(dá)，例如編碼鉀離子通道亞基Kv9.3的Kcns3表達(dá)量在頂回最高，其次在中回，在底回最低。而一些基因沿頻率響應(yīng)軸的表達(dá)差異還具有亞型特異性。例如，編碼軸突導(dǎo)向分子Ephrin A1的EFNA1基因在Ib型SGNs中，在中回和底回的表達(dá)水平高于頂回，而在Ia和Ic型SGNs中僅在底回富集。Kcnip2和Cpne6在Ib和Ic型SGNs中均從頂回-底回呈梯度上升表達(dá)，在Ia型SGNs中則僅在底回富集。編碼電壓門控鈣離子通道亞基的Cacng5表達(dá)模式更加復(fù)雜，其在Ic型SGNs中從頂回-底回呈梯度下降，在Ia型SGNs中僅從頂回-中回呈梯度下降，而在Ib型SGNs中表達(dá)相對均勻?？傊撗芯客ㄟ^對頻率響應(yīng)軸各型SGNs的分析，發(fā)現(xiàn)了分別在Ia、Ib和Ic型SGNs中具有頻率響應(yīng)區(qū)域差異的184、157和183個(gè)基因，在這524個(gè)基因中，有494個(gè)是特異的。因此，對各個(gè)亞型的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析揭示了SGNs頻率響應(yīng)區(qū)差異性的一個(gè)新層面。

此外，耳蝸三個(gè)區(qū)域中SGNs亞型的比例也存在不同。在中回分別有33%Ia、45%Ib、22%Ic型SGNs；頂回與之相似(31%Ia，43%Ib和26%Ic型SGNs)，而底回的Ia型SGNs比例相對較高(46%)，Ib型SGNs較少(24%)。因此，SGNs亞型組織水平分布的差異疊加于基因表達(dá)梯度，形成頻率響應(yīng)特征。

2.4SGNs的三種分子學(xué)分型與傳統(tǒng)分型的解剖和形態(tài)差異匹配 早年已有研究表明三種SR特性的SGNs存在突觸大小的差異和空間分離投射。該研究以在Ia、Ib和Ic型SGNs中差異表達(dá)的鈣結(jié)合蛋白 CALB2為分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)CALB2的Ic型SGNs軸突更接近前庭階(scala vestibule, SV)，并與IHCs的蝸軸側(cè)形成大的帶狀突觸。相反，高表達(dá)CALB2的Ia型SGNs軸突纖維更接近鼓階(scala tympani, ST)，與IHCs的柱狀細(xì)胞形成小的帶狀突觸。具有中等CALB2表達(dá)水平的Ib型SGNs位于中間，與IHCs形成中等大小的帶狀突觸。證實(shí)了通過分子差異分型的Ia、Ib和Ic型SGNs纖維位置、突觸位置和突觸形態(tài)，分別與高、中和低SR亞型SGNs的特征相匹配，見圖4。

圖4 Ia、Ib和Ic型SGNs與IHC連接位置

2.5Ic型SGNs對年齡相關(guān)有選擇易感性 早年的研究表明，SGNs隨著衰老逐漸丟失，其中低SR的SGNs纖維受影響最大。該研究則通過分子標(biāo)記的方法(以Calb2和Lypd1的表達(dá)來確定分型)分別評估了32、64和108周齡小鼠的Ia、Ib和Ic型SGNs數(shù)量，發(fā)現(xiàn)總SGNs密度隨著年齡的增長而下降，且只有Ic型SGNs表現(xiàn)出相似的下降趨勢，從32周時(shí)的30%下降到64周時(shí)的20%，并且在108周時(shí)進(jìn)一步降至11%。而Ia和Ib型SGNs比例相對上升，表明Ic型SGNs對年齡相關(guān)性聽力損失有選擇易感性，與此前的研究進(jìn)一步對應(yīng)。

2.6SGNs亞型特征在出生時(shí)出現(xiàn)并在出生后的第一周內(nèi)完善 通常，神經(jīng)元在有絲分裂后即表現(xiàn)出特性，并受到神經(jīng)功能環(huán)路活動(dòng)的調(diào)控。在小鼠耳蝸中，I型和II型SGNs在胚胎第16.5天(E16.5)即表現(xiàn)出不同的解剖學(xué)特征。相比之下，I型SGNs的亞型差異在出生后、周圍突到達(dá)IHCs之后才能被檢測到，而IHCs-SGNs間突觸形態(tài)直到出生后第4周才完全成熟。

該研究借助亞型特異標(biāo)記物進(jìn)一步研究了SGNs分型的時(shí)間進(jìn)程，他們發(fā)現(xiàn)SGNs在圍產(chǎn)期開始出現(xiàn)差異，并在出生后第一周內(nèi)細(xì)化分型。Ia型SGNs標(biāo)記物Calb2和Ic型SGNs標(biāo)記物L(fēng)ypd1在胚胎晚期階段(E18.5)和出生時(shí)耳蝸的表達(dá)較均一，還無法區(qū)分SGNs的亞型。到出生后第3天(P3)，一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出Calb2和Lypd1的互斥表達(dá)，出生后第7天(P7)耳蝸SGNs差異表達(dá)Calb2和Lypd1的梯度更加明顯，低表達(dá)Calb2的神經(jīng)元表達(dá)了高水平的Lypd1。在出生后第26天(P26)時(shí)，90%的SGNs表現(xiàn)為 Calb2和Lypd1互斥表達(dá)。這表明SGNs在出生時(shí)表達(dá)的分子廣泛重疊，出生后某些分子表達(dá)開始受到限制，第一周后出現(xiàn)了類似成年SGNs各亞型互斥表達(dá)的分子標(biāo)志，逐漸形成了各亞型SGNs。

2.7IHCs突觸傳遞信號(hào)是出生后SGNs分型的必要條件 小鼠在出生后第12天左右開始對氣導(dǎo)聲音信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，耳蝸功能發(fā)育完善則持續(xù)到出生后第3周。在此期間，IHCs釋放谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)誘發(fā)SGNs產(chǎn)生動(dòng)作電位。為了解這些突觸信號(hào)聯(lián)系是否影響SGNs形成內(nèi)在差異，該研究首先對IHCs到SGNs谷氨酸傳遞缺失的成年小鼠(Vglut3-/-)進(jìn)行了scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)其SGNs只能被分成兩群，80%的細(xì)胞主要表達(dá)Ia型SGNs的標(biāo)記(如Calb2)，20%的細(xì)胞主要表達(dá)Ib型SGNs的標(biāo)記(Ntng1，Pou4f1)和極低水平Ic型SGNs標(biāo)記(Lypd1，Grm8)。為明確Vglut3-/-小鼠SGNs的異常分型在何時(shí)出現(xiàn)，他們進(jìn)一步分析了耳蝸早期發(fā)育階段SGNs各亞型特異標(biāo)志物的表達(dá)。在出生后第3天，Vglut3-/-小鼠SGNs表達(dá)標(biāo)志分子與野生型相似，表明SGNs分型的初始不依賴于IHCs的活動(dòng)。然而從出生后第8天至第4周，Vglut3-/-小鼠中表達(dá)Ic型SGNs標(biāo)記物L(fēng)ypd1+的細(xì)胞比例逐漸降低，表達(dá)Ia型SGNs的標(biāo)記Calb2+的SGNs比例增加，在出生后第27天時(shí)最顯著，見圖5。

以上結(jié)果表明， SGNs在出生后逐漸分成各亞型的過程需要IHCs活動(dòng)的誘導(dǎo)，出生后一周內(nèi)IHCs活動(dòng)若受損，將導(dǎo)致SGNs分型異常，并持續(xù)至成年。

圖5 Vglut3-/-小鼠發(fā)育階段I型SGNs的異常分型

3 對疾病認(rèn)識(shí)和治療的意義及展望

Vglut3的突變是人類DFNA25耳聾的基礎(chǔ)。該研究證明了SGNs的分型依賴于出生后早期IHCs的正常活動(dòng)，這可能是某些類型的先天性耳聾--尤其是聽力發(fā)生前即出現(xiàn)SGNs功能受損的致病機(jī)制。這提示我們在評估與致聾突變相關(guān)的主要細(xì)胞(如IHCs)時(shí)，還應(yīng)注意包括SGNs在內(nèi)的細(xì)胞異常。該研究還嘗試回答了一個(gè)重要的問題，即如果對IHCs缺陷的先天性耳聾進(jìn)行基因治療恢復(fù)其功能，是否能夠挽救相關(guān)的SGNs損傷表型。在某種程度上，這取決于SGNs分型的可塑性，尤其是其在成年之后是否還能受IHCs活動(dòng)的誘導(dǎo)。未來的研究或許可以直接以SGNs為靶點(diǎn)，通過在聽覺發(fā)育期，甚至是成年后重構(gòu)其各個(gè)亞型的比例，探究SGNs相關(guān)治療的新途徑。

(摘譯自：Shrestha BR, Chia C, Wu L, et al.Sensory neuron diversity in the inner ear is shaped by activity[J].Cell,2018,174:1229.)