荊小袁， 陸 敏

百日咳（pertussis）是一種傳染性極強(qiáng)的呼吸系統(tǒng)的感染性疾病，由百日咳鮑特桿菌（簡稱百日咳桿菌）感染所引起，是嚴(yán)重威脅兒童健康及生命的主要傳染病之一。百日咳桿菌所產(chǎn)生的百日咳毒素（pertussis toxin，PT）是其重要的功能性毒性因子[1-2]。該病臨床上以逐漸加重的咳嗽癥狀為主要表現(xiàn)，呈典型的陣發(fā)性、痙攣性咳嗽，咳畢可伴有雞啼樣吸氣聲；對嬰幼兒具有嚴(yán)重危害，有時(shí)可引起致命的并發(fā)癥，特別是對于還沒有完成疫苗接種的兒童[3-6]。

百白破三聯(lián)疫苗（DTP）的接種能夠顯著降低百日咳的發(fā)病率，使百日咳的發(fā)生得到有效控制。但近20年來，部分國家，尤其是疫苗覆蓋率較高的地區(qū)，又出現(xiàn)復(fù)發(fā)的傾向，甚至出現(xiàn)局部的暴發(fā)性流行，稱為“百日咳再現(xiàn)”[7-8]。目前，百日咳桿菌感染依然是導(dǎo)致嬰兒死亡的一個(gè)重要原因。據(jù)報(bào)道，全球每年大約有4 850萬人感染百日咳，其中近30萬人未能成功救治[9]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，家庭成員（尤其是父母）及青少年是兒童患百日咳的主要感染源，約占兒童百日咳病例的76%～83%[10-12]；其傳播模式亦由兒童→兒童轉(zhuǎn)變?yōu)楦改讣扒嗌倌辍鷥和驄胗變篬13-14]。

我國人口密度大，醫(yī)療衛(wèi)生及監(jiān)測體系尚不完善，以及對百日咳主要基于臨床表現(xiàn)的診斷方法，致使百日咳的檢出率明顯低于真實(shí)水平。本研究旨在了解兒童百日咳感染的流行病學(xué)特征，評估百日咳在兒童中的發(fā)生率，從而為兒童新的疫苗接種政策提供依據(jù)。

為了解上海市兒童百日咳抗體水平，評價(jià)百白破三聯(lián)疫苗的免疫效果和接種質(zhì)量，指導(dǎo)免疫方案的制定，本研究通過收集2015年2月－2017年2月至我院兒童保健科行健康查體的兒童血清樣本，對本市兒童的百日咳抗體水平進(jìn)行監(jiān)測分 析。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 同意使用從其他醫(yī)療原因獲得的額外血清標(biāo)本，年齡在0～18歲的受試者。所有檢查均獲得其家長或監(jiān)護(hù)人的知情同意。受試者無嚴(yán)重的慢性疾病。

1.1.2 剔除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡＞3歲且1年內(nèi)接種百白破無細(xì)胞疫苗（DTaP）或含DTaP的兒童；②免疫功能低下（包括接受免疫抑制劑）的兒童；③過去12個(gè)月靜脈注射免疫球蛋白的兒童。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)要求 ①在知情同意的情況下，抽取受試兒童2.5 mL外周血，送至上海市兒童醫(yī)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行統(tǒng)一檢測；②于抽血1 h內(nèi)將血清分離，并收集2份至少300 μL的血清標(biāo)本至血清小瓶內(nèi)，于-80 ℃保存至需要時(shí)取用；③標(biāo)本運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室過程中需置于干冰中保持溫度。

1.2.2 檢查方法 采用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷股份公司生產(chǎn)的抗百日咳桿菌毒素抗體IgG（抗-PT IgG）檢測試劑盒（試劑批號E140819AM），檢測受試者血清抗百日咳抗體IgG水平，單位以國際單位（IU）/mL表 示。

1.2.3 判斷依據(jù) 定標(biāo)：采用國際WHO標(biāo)準(zhǔn)（WHO國際標(biāo)準(zhǔn)百日咳抗體，人，NIBSC編碼：06/140）進(jìn)行質(zhì)控校準(zhǔn)，以IU/mL進(jìn)行定量。判斷標(biāo)準(zhǔn)：參照歐蒙試劑盒提供的產(chǎn)品說明書及相關(guān)研究結(jié)果[15-16]，并結(jié)合我國的免疫接種計(jì)劃，以血清抗體水平＜30 IU/ mL判斷為血清抗體陰性，提示近期未接觸百日咳桿菌；血清抗體水平≥30 IU/mL判斷為抗體陽性，提示近期接觸過百日咳桿菌；血清抗體水平≥100 IU/mL提示為急性感染（過去1年內(nèi)未接種DTaP或含DTaP疫苗）或近期免疫。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。定性變量以百分比表示，定量變量以95%可信區(qū)間（95%CI）表示。通過卡方檢驗(yàn)對定性變量資料（抗體陽性率）進(jìn)行組間比較，通過單向方差分析（one-way ANOVA test）和兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對定量變量資料（血清抗體濃度）進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)， 判斷差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的特點(diǎn)

2.1.1 0～18歲研究對象的特點(diǎn) 本研究共納入受試者372名，所有研究對象均選自2015年2月－2017年2月在我院兒童保健科就診行健康查體的兒童。其中男童217名（58.3%），女童155名（41. 7%）。按年齡段將其分為5組：＜3歲（0～35個(gè)月）86名（23.1%），3～5歲67名（18.0%），6～9歲73名（19.6%），10～12歲70名（18.8%），13～18歲76名（20.4%），見表1。

2.1.2 3歲以下研究對象的特點(diǎn) 由于3歲以下兒童為我國百日咳疫苗的主要接種對象，其血清抗體水平可能受到接種疫苗的影響。按照疫苗接種時(shí)間，我們將該年齡段86例研究對象分為6組：＜3月齡，3～5月齡，6～12月齡，13～18月齡，19～24月齡，25～35月齡。進(jìn)一步了解該年齡段兒童的血清抗體水平的特點(diǎn)，見表2，圖1。

表1 上海0～18歲兒童的人口數(shù)據(jù)資料和抗-PT IgG抗體水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述Table 1 Demographic data and serum level of anti-Bordetella pertussis toxin IgG antibody in children (0-18 years old) in Shanghai

表2 上海3歲以下兒童的數(shù)據(jù)資料和抗-PT IgG抗體水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述Table 2 The data of serum anti-Bordetella pertussis toxin IgG antibody in terms of age group (＜3 year old) in Shanghai

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果

2.2.1 0～18歲兒童血清抗-PT IgG的水平檢測 本研究中372名研究對象，血清抗-PT IgG的抗體陽性率為11.29%（≥30 IU/mL），平均水平為16.21（95%CI：11.43～20.99）IU/mL。

抗-PT IgG的平均水平最高的是＜3歲組（21.82 IU/mL，95%CI：12.39～31.25 IU/ mL）和10～12歲組（21.16 IU/mL，95%CI：5.06～37.27 IU/ mL），最低的是6～9歲年齡組（9.74 IU/mL，95%CI：3.70～15.77 IU/mL）。各年齡組的抗-PT IgG的平均水平及95%CI在表1中列 出。

男性的平均抗體水平為17.23（95%CI：10.00～24.45）IU/mL，女性的平均抗體水平為14.84（95%CI：9.30～20.83）IU/mL，兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)顯示，兩者的抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.605）。

單向方差分析顯示，0～18歲的5個(gè)年齡組之間的平均抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.431）。進(jìn)一步將水平最低的年齡組（6～9歲組）分別與2個(gè)抗體水平較高的年齡組（＜3歲組和10～12歲組）進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)顯示，＜3歲組受試者的抗-PT IgG平均水平明顯高于6～9歲組（P=0.033）；而10～12歲組和6～9歲組之間的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.188）。

2.2.2 血清抗-PT IgG的陽性率檢測 在372名受試者中，血清抗-PT IgG的水平在（30～＜100）IU/ mL的受試者29例（7.80%），提示近期接觸過百日咳桿菌；其中，＜3歲組（12.79%）和10～12歲組（7.14%）陽性率最高，3～5歲組陽性率最低（4.48%）。血清抗-PT IgG的水平≥100 IU/mL的受試者13名（3.49%），提示急性感染或近期免疫；其中，＜3歲組（5.81%）和10～12歲組（4.29%）陽性率最高，13～18歲組陽性率最低（1.32%）。血清陽性率在各年齡組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.562）。如表1所 示。

血清抗-PT IgG的水平在（30～＜100）IU/ mL者，男性受試者13名（5.99%），女性受試者16名（10.32%）；血清抗-PT IgG的水平≥100 IU/mL者，在男性受試者中為9名（4.15%），女性受試者中為4名（2.58%）。兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.236）。

2.2.3 ≥3歲兒童血清抗-PT IgG的陽性率檢測 受試者中，3～18歲年齡段有286名，其中血清抗-PT IgG水平在（30～＜100）IU/mL者18名（占該年齡段6.29%），血清抗-PT IgG的水平≥100 IU/mL者8名（占該年齡段2.79%）。各年齡組間血清陽性率的比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.949）。

2.2.4 3歲以下兒童血清抗-PT IgG的陽性率檢測 86名＜3歲嬰幼兒中，血清抗-PT IgG的水平在（30～＜100）IU/mL者11名（占該年齡段12.79%），血清抗-PT IgG的水平≥100 IU/mL者5名（占該年齡段5.81%），兩者占比均為各年齡組中的最高值。

我國兒童DTP的接種時(shí)間為3、4、5月齡各接種1針和18～24月齡的一次強(qiáng)化注射。對3歲以下兒童血清抗-PT IgG水平的研究發(fā)現(xiàn)，＜3月齡的嬰兒體內(nèi)的抗體水平最低，平均2.89（95%CI：-?3.87～9.65）IU/mL。其后，隨著疫苗接種，兒童體內(nèi)的抗體水平逐漸增高，當(dāng)3次疫苗接種完成后，體內(nèi)抗體水平達(dá)到最高53.09（95%CI：16.37～89.82）IU/mL。隨后逐漸下降，當(dāng)完成第4針接種后，在25～35個(gè)月階段的抗體水平出現(xiàn)第二個(gè)小高峰16.89（95%CI：0.69～32.73）IU/mL。見表2和圖1。

2.2.5 百日咳桿菌感染發(fā)病率的預(yù)測 目前，由于使用試劑、檢測方法以及疫苗接種的不同，世界上不同地區(qū)對血清抗-PT IgG陽性率的判斷存在差異。本研究中，我們根據(jù)中國兒童的血清抗-PT IgG水平及實(shí)驗(yàn)所使用的歐蒙試劑盒提供的產(chǎn)品說明書，并參照已發(fā)表的關(guān)于血清抗-PT IgG水平相關(guān)研究的文獻(xiàn)，將30 IU/mL的血清抗-PT IgG水平作為診斷血清陽性的最低標(biāo)準(zhǔn)，用以評估百日咳桿菌感染的發(fā)生率[15-17]。

3 討論

在我國已報(bào)道的百日咳病例中，嬰幼兒占一半以上，但其中只有40%～50%病例有典型的陣發(fā)性、痙攣性咳嗽表現(xiàn)，大部分常無典型痙咳，往往咳嗽數(shù)聲后即出現(xiàn)屏氣發(fā)紺，易致窒息、驚厥，若不及時(shí)行人工呼吸、給氧等積極搶救，可窒息死亡[18]。近年來，百日咳在青少年和成人的發(fā)病率明顯增高，但其大多無典型的臨床表現(xiàn)，易被誤診為一般的呼吸道感染，成為嬰幼兒的重要傳染源[19-20]。目前，由于確診百日咳診斷的實(shí)驗(yàn)室檢查在我國并未常規(guī)開展，以及疫苗接種等原因?qū)е略S多患兒臨床表現(xiàn)不典型，致使很多沒有典型臨床表現(xiàn)的百日咳患兒可能被漏診。這使得已報(bào)道的百日咳發(fā)病率明顯低于真實(shí)水平。本研究通過對0～18歲兒童血清抗-PT IgG水平的橫斷面研究，了解上海地區(qū)百日咳抗體在各年齡段兒童中的血清陽性率。

本研究中，372名研究對象的血清抗-PT IgG水平平均值為16.21（95%CI：11.43～20.99）IU/ mL，各年齡組研究對象的血清平均抗體水平波動(dòng)于9～22 IU/mL。該結(jié)果與我國近年來關(guān)于百日咳桿菌感染的相關(guān)報(bào)道結(jié)果相符[21-22]，但較歐美地區(qū)的調(diào)查結(jié)果則偏低[23-24]，考慮可能與不同國家免疫計(jì)劃的差異有關(guān)。

我國現(xiàn)行的百日咳免疫程序規(guī)定，3、4、5月齡行基礎(chǔ)免疫，18月齡行加強(qiáng)免疫。本次研究發(fā)現(xiàn)，在3歲以下兒童中，＜3月齡的年齡組中抗體平均水平最低，為2.89 IU/mL，這可能與該年齡段尚未接種疫苗有關(guān)，而成人血清百日咳抗體水平很低[22]，導(dǎo)致母體不能有效提高新生兒的抗體水平。由此可以推斷，母親在妊娠期間接種百日咳疫苗有可能降低3月齡以下嬰兒百日咳的發(fā)生率。3～5月齡的嬰兒接受疫苗注射，其抗體水平明顯升高；當(dāng)3針接種完成后（6～12月齡），體內(nèi)抗體水平達(dá)到最高水平（平均水平53.09 IU/mL）；隨后抗體逐漸消退，直至進(jìn)行第4針強(qiáng)化接種完成后（3歲以下），抗體水平又有所升高。各年齡組間平均水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。這種抗體水平的變化與我國兒童的百日咳疫苗接種是相符合的。同時(shí)這也說明，該年齡段兒童抗體水平的陽性可能與疫苗接種有關(guān)，并不一定為百日咳桿菌接觸或患有百日咳。因此，3歲以下年齡段兒童血清百日咳抗體水平的檢測主要用于對DTP接種效果的評 估。

本研究中選取的研究對象，除3歲以下年齡組之外，所有受試者均按計(jì)劃完成4針DTP接種，近1年內(nèi)未接受DTaP（或含DTaP疫苗）以及丙種球蛋白注射。參照實(shí)驗(yàn)所使用的試劑說明書、我國的計(jì)劃免疫和已有研究[22]， 本次研究將30 IU/mL作為預(yù)測血清抗體陽性的截?cái)嘀担瑢ⅰ?00 IU/mL的血清抗-PT IgG水平作為近期感染（過去1年內(nèi)未接受DTaP或含DTaP疫苗）的標(biāo) 準(zhǔn)。

研究顯示，兒童時(shí)期感染百日咳或接種疫苗后產(chǎn)生的血清免疫，3～5年后逐漸消退，10年后可降至原來的0～20%[25-27]。為消除疫苗接種的影響，小于3歲年齡段兒童的血清抗體水平僅作為參照，我們主要對3歲以上兒童百日咳感染的發(fā)病率進(jìn)行預(yù)測。該年齡段兒童的血清抗-PT IgG抗體陽性與百日咳桿菌感染密切相關(guān)，可作為預(yù)測百日咳桿菌感染（尤其是臨床表現(xiàn)不典型患兒）的指 標(biāo)。

盡管我國目前DTP接種已在全國大部分地區(qū)較好地實(shí)施，但百日咳在各年齡組兒童中仍普遍存在。本次研究顯示，在3～18歲年齡段中，血清抗-PT IgG的水平≥100 IU/mL者占2.79%，提示該年齡段兒童百日咳桿菌急性感染的發(fā)生率為2.79%，明顯大于我國百日咳發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)值（約0.2/10萬）[28]。臨床上，部分兒童（尤其是大齡兒童）感染百日咳后臨床表現(xiàn)不典型且無明顯癥狀，常被誤診為普通呼吸道感染。這可能是百日咳發(fā)病率的報(bào)道數(shù)據(jù)明顯低于實(shí)驗(yàn)室檢查感染率的主要原因。同時(shí)提示我們，抗體陽性表示百日咳桿菌感染或暴露，但并不一定引起百日咳的典型臨床表現(xiàn)。

現(xiàn)有研究表明，百日咳在各年齡段均存在漏診現(xiàn)象，且在青少年和成人中明顯高于小年齡兒童[4，29]。我們的研究亦發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。這可能是大齡兒童感染百日咳后臨床表現(xiàn)不典型，容易被誤診為普通呼吸道感染所造成的。而這部分患兒由于癥狀較輕，大多不能引起重視并得到有效治療，從而成為尚未完成疫苗接種嬰幼兒的重要傳染源 [7-19]。

在我國，兒童多在3歲以前完成4針DTP的免疫接種，之后尚沒有進(jìn)一步的強(qiáng)化免疫計(jì)劃。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測血清抗-PT IgG水平的方法（如ELISA等）不能區(qū)分抗體水平的升高是感染所致還是疫苗接種所致。根據(jù)推測，＜3歲的嬰幼兒是進(jìn)行疫苗接種年齡段，且具有較高的易感性，其血清抗體水平應(yīng)明顯高于其他年齡段。但本研究發(fā)現(xiàn)，雖然＜3歲年齡組受試者血清抗-PT IgG抗體平均水平（21.82 IU/mL，95%CI：12.39～31.25 IU/mL）和陽性率（18.60%）最高，但各月齡組間抗體陽性率的比較并未發(fā)現(xiàn)顯著差異。本研究共納入372名研究對象，由于樣本量的限制，結(jié)果可能存在一定的局限性，更多的樣本尤其是較大年齡段樣本的納入更有利于增加研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究表明，百日咳桿菌感染在我國各年齡段兒童中普遍存在，在已完成免疫接種的兒童中，以10～12歲年齡組的發(fā)生率最高?？紤]到這一年齡段的患兒接觸百日咳桿菌的可能性較大，且幼時(shí)疫苗接種所獲得的抗體已經(jīng)基本消退，是百日咳感染易感人群，更是引起嬰幼兒感染的傳染源，對其進(jìn)行強(qiáng)化疫苗接種可能有助于顯著降低各年齡段兒童百日咳的發(fā)病率。3個(gè)月以內(nèi)的小嬰兒血清抗體水平非常低，易發(fā)生百日咳桿菌的感染，在母親妊娠階段或妊娠前期進(jìn)行預(yù)防接種可能有助于提高該年齡段的血清抗體水平，降低其百日咳的發(fā)病率。