牛美蘭， 裴巖巖， 王 鵬， 范媛媛， 陳長英， 王世廣， 袁 武

輪狀病毒（rotavirus， RV）是5歲以下小兒重癥腹瀉最常見的病原體，威脅著全世界嬰幼兒的健康及生命，發(fā)展中國家尤為嚴重[1]。腹瀉的本質在于腸道分泌功能與吸收功能之間的平衡失調[2]，鈉氫交換蛋白3（Na+-H+exchanger 3，NHE3）主要表達于哺乳動物腸道上皮細胞刷狀緣膜表面，與腸道大部分的NaCl、NaHCO3和水分的吸收有關，參與多種腸道生理病理過程。研究報道NHE3基因敲除的小鼠，腸管對水鈉的吸收減少并出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀[3]。在炎性腸病及霍亂毒素誘導的腹瀉中，NHE3的表達和活性也均受到明顯的抑制[4]。有研究報道，NHE3的急性調控可以通過細胞內吞和/或胞吐率的變化來調節(jié)[5]。網(wǎng)格蛋白（clathrin）依賴性內吞途徑是一種普遍存在、占主導地位的細胞外物質內化方式[6]。Caco-2細胞與人小腸上皮細胞在形態(tài)學上相似，具有相同的細胞極性和緊密連接，但NHE3 的表達水平很低，本研究利用3HA-NHE3 腺病毒轉染單層極化Caco-2細胞構建表達NHE3單層極化Caco-2細胞模型，利用clathrin拮抗劑氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ），研究RV感染是否經(jīng)由clathrin依賴性的內吞途徑調控細胞表面NHE3水平及其生物活性，為尋找RV感染性腹瀉新的治療靶點和藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)液、FBS等購自Thermo Fisher 科技公司。BCECF-AM、HOE694和抗兔NHE3抗體、抗兔Clathrin抗體和抗鼠GAPDH抗體均購自Santa Cruz生物科技公司。Goat Anti-Rabbit IgG H&L （Alexa Fluor?680）和Goat Anti-Mouse IgG H&L （Alexa Fluor?790）抗體購自Abcam公司。Transwell細胞培養(yǎng)盤購自Corning 公司。TRIzol試劑購自Invitrogen公司。其他試劑購自Sigma Aldrich 公司。Caco-2細胞購自中國科學院細胞庫。HA-NHE3腺病毒受贈于美國Johns Hopkins University的Donowitz教授。

1.2 方法

1.2.1 表達NHE3的單層極化Caco-2細胞模型的構建 Caco-2 細胞以1.2×105/cm2接種于裝有聚碳酸酯膜的細胞培養(yǎng)插件的Transwell 培養(yǎng)盤中，培養(yǎng)12 d 后，更換為無血清培養(yǎng)液，轉染表達3HANHE3 腺病毒，6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，形成表達3HA-NHE3單層極化Caco-2細 胞。

1.2.2 細胞表面NHE3生物素化測定 構建好的表達3HA-NHE3 的單層極化Caco-2細胞分為4組，分別為對照組（CTL組）、RV 組、CPZ組和CPZ+RV組，分別加入等體積無血清培養(yǎng)液、RV 病毒液（MOI10）、CPZ液（10 μmol/L）和CPZ+RV液，在37 ℃，5% CO2條件下孵育60 min。棄去培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于冰上，冷PBS液清洗3遍，冷硼酸緩沖液清洗1遍后，加入含有1 g/ L NHS-SS-biotin的硼酸緩沖液孵育60 min后，Quenching 緩沖液去除未結合的生物素，再用冷PBS清洗3遍后裂解細胞。細胞裂解液4?℃，5 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用Bradford法測定蛋白濃度后，將細胞裂解液的蛋白濃度調節(jié)為1 g/L。每組抽取0.9 mL的細胞裂解液與鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖珠混合均勻后，在4?℃環(huán)境下旋轉混合孵育3 h。4?℃，1 500 r/min，離心3 min。冷細胞裂解液清洗5次去除非特異結合蛋白后，加入90 μL上樣緩沖液，煮沸10 min，4?℃，1 500 r/min離心3 min，收集上清液（細胞膜表面NHE3）。每組的細胞總裂解液30 μL和細胞表面蛋白成分60 μL點樣，采用SDS-PAGE分離、轉膜、封閉后，用抗鼠HA抗體（檢測3HANHE3）和抗兔GAPDH 4?℃孵育過夜后，相應熒光二抗孵育2 h，最終用Odyssey Infrared Imaging System掃描后進行數(shù)據(jù)分析，分別檢測總NHE3和細胞表面NHE3的信號強度，計算總NHE3/GAPDH以及細胞表面NHE3/GAPDH的值。

1.2.3 Na+-H+交換活性測定 Caco-2細胞以1.2×105/cm2的細胞濃度接種于自制帶有聚碳酸酯膜的塑料蓋玻片膜上，5% CO2，37?℃培養(yǎng)12 d后，轉染3HA-NHE3腺病毒，轉染6 h，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，更換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)液更換為40 mmol/L 的Na+/NH4Cl 溶液，加入10 μmol/L熒光探針BCECF-AM，并將細胞分為CTL組、RV 組、CPZ組和CPZ+RV組，分別加入等體積無血清培養(yǎng)液、RV 病毒液、CPZ液和CPZ+RV液，在37?℃，5% CO2條件下孵育60 min后，測定Na+-H+交換活性，并利用pH6.0、6.6、7.3 的K+/nigericin梯度緩沖液擬合標準曲線。根據(jù)標準曲線，計算Na+-H+交換活性[7]。

1.2.4 Western blot法檢測clathrin表達水平 表達3HA-NHE3 單層極化Caco-2細胞，分為CTL組、RV 組及CPZ+RV組，分別加入等體積無血清培養(yǎng)液、RV 病毒液和CPZ+RV液，在37?℃，5% CO2條件下孵育60 min。棄去培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于冰上，冷PBS液清洗3遍，裂解細胞提取蛋白，細胞裂解液4?℃，5 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用Bradford法測定蛋白濃度后，將細胞裂解液的蛋白濃度調節(jié)為1 g/L。每組細胞裂解液30 μL點樣，采用SDS-PAGE分離、轉膜、封閉后，用抗鼠clathrin抗體和抗兔GAPDH抗體4?℃孵育過夜后，相應熒光二抗孵育2 h，最終用Odyssey Infrared Imaging System掃描后進行數(shù)據(jù)分析，檢測clathrin和GAPDH蛋白水平，計算clathrin/GAPDH的值。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 結果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗檢驗后，進行單因素方差分析，采用Student Newman Keulst檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RV感染對Na+-H+交換活性的影響

各組細胞Na+-H+交換活性測定圖像如圖1A所示，利用pH6.0、6.6、7.3 的K+/nigericin梯度緩沖液擬合標準曲線。根據(jù)標準曲線，計算Na+-H+交換活性。數(shù)據(jù)計算結果顯示，與CTL組（0.350±0.016）相比，RV感染可引起細胞NHE3的生物活性（0.176±0.012）明顯降低（P＜0.05），CPZ組NHE3的生物活性（0.344±0.018）與CTL組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），并且能夠將RV感染抑制的NHE3活性（0.248±0.017）提高，但沒有恢復到正常水平（P＜0.05）。見圖1B。

圖1 RV感染對Na+-H+交換活性的影響（x ± s，n=3）Figure 1 Effect of rotavirus infection on Na+-H+ exchange activity ( x ± s，n=3)

2.2 RV對細胞NHE3蛋白水平的影響

細胞表面NHE3 生物素化法檢測發(fā)現(xiàn)，各組細胞NHE3蛋白總量沒有發(fā)生明顯變化（P＞0.05），見圖2。然而，與CTL組（0.698±0.032）相比，RV組感染表達HA-NHE3的單層極化Caco-2細胞60 min后，細胞表面NHE3的表達（0.306±0.029）明顯降低（P＜0.05），CPZ組細胞表面NHE3的表達水平（0.761±0.093）與CTL相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但RV感染對細胞表面NHE3的抑制作用可被CPZ所拮抗恢復至0.533±0.064，但沒有恢復至CTL組水平（P＜0.05）。見圖3。

2.3 RV對細胞clathrin水平的影響

Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，與CTL（0.188±?0.015）相比，RV感染引起細胞clathrin表達（0.287±0.013）明顯升高（P＜0.05），而這一作用可被CPZ明顯抑制（0.167±0.015），與CTL組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

3 討論

圖2 RV 感染對細胞NHE3總量的影響（x ± s，n=3）Figure 2 Effect of rotavirus infection on total protein level of NHE3 ( x ± s，n=3)

圖3 RV 感染對細胞表面NHE3水平的影響（x ± s，n=3）Figure 3 Effect of rotavirus infection on surface protein level of NHE3 ( x ± s，n=3)

圖4 RV 感染對細胞Clathrin水平的影響（ x ± s，n=3）Figure 4 Effects of rotavirus infection on cellular protein level of clathrin ( x ± s，n=3)

RV腸炎的發(fā)病機制十分復雜，傳統(tǒng)認為RV感染引起腹瀉首先是因為小腸黏膜的破壞，上皮細胞功能降低，吸收面積變小，導致腸吸收不良；其次是乳糖酶的缺乏導致腸道乳糖吸收障礙，此外細胞對乳糖的分解產(chǎn)物堆積造成腸腔滲透壓的升高，也是產(chǎn)生腹瀉的原因[8]。RV感染性腹瀉病理學研究結果發(fā)現(xiàn)病變多局限于小腸，腸道黏膜可以無改變或僅有輕微改變，炎性浸潤輕微[9]，因此對于早期腸道黏膜未出現(xiàn)損傷或病理檢查無腸道病理損害者出現(xiàn)的腹瀉癥狀不能用上述理論解釋，RV 腸炎可能還涉及其他致瀉機制。因此，RV感染引起的腹瀉機制有待我們進一步深入探索，對于尋找更為有效的藥物和治療靶位是至關重要的環(huán)節(jié)。

NHE家族屬于SLC9A基因家族[10]，其中NHE3的活性狀態(tài)及表達水平與腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關，而NHE3活性的急性調控既可以發(fā)生于正常的消化生理過程，也可以發(fā)生于腹瀉的病理生理過程。免疫共定位研究發(fā)現(xiàn)細胞內有重要的NHE3池，無論是動物腸組織還是培養(yǎng)的上皮細胞，NHE3不僅分布于細胞表面，還大量地存在于近頂端小囊泡，刺激可引起NHE3迅速向細胞表面轉運。NHE3這種獨特的分布特點在其活性調節(jié)和功能發(fā)揮中起重要影響[11]。NHE3在頂膜和胞內池之間的轉運可以通過細胞內吞和/或胞吐率的變化來調節(jié)，從而實現(xiàn)NHE3的急性調控[12]。本研究通過細胞表面NHE3生物素檢測實驗發(fā)現(xiàn)RV感染Caco-2細胞60 min能夠明顯降低細胞表面NHE3的水平，這一現(xiàn)象與RV感染降低細胞Na+-H+交換活性一致，然而RV感染對細胞NHE3總量不產(chǎn)生影響[13-14]，提示RV感染對細胞表面NHE3水平及其生物活性抑制不是發(fā)生在基因轉錄和翻譯的過程，而是通過對NHE3的轉運進行調控。

內吞一般可分為clathrin依賴性和非依賴性途徑。其中，clathrin依賴性途徑是一種普遍存在、占主導地位的細胞外物質內化方式。多種生物活性物質通過clathrin途徑被內吞。已有研究證明，clathrin內吞途徑參與了NHE3轉運調控機制[6]。但RV是否通過clathrin內吞途徑調控NHE3的轉運尚無文獻報道。本研究結果發(fā)現(xiàn)，RV感染可明顯提高clathrin的表達水平，從而提高細胞內吞功能，可能是RV感染能夠降低細胞表面NHE3蛋白水平的原因。同時，研究發(fā)現(xiàn)clathrin拮抗劑CPZ可有效拮抗RV感染對細胞表面NHE3水平和生物活性的抑制作用，提示clathrin依賴性內吞途徑與RV感染對細胞NHE3的抑制作用有關。但CPZ不能完全拮抗RV感染對細胞表面NHE3的抑制作用，又提示RV感染對細胞表面NHE3的抑制可能還與其他的內吞途徑有關。

RV感染性腹瀉機制至今尚不明確，NHE3及其生物活性與腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)RV感染可明顯抑制細胞表面NHE3水平及其生物活性，這一抑制作用可能是經(jīng)由clathrin依賴性內吞途徑產(chǎn)生的。然而RV感染對NHE3的抑制作用是否還存在其他的調控機制值得我們進一步深入探索，從而為揭示RV感染性腹瀉的發(fā)生機制提供新的研究思路，也為尋找RV感染性腹瀉新的治療靶點和藥物提供理論依據(jù)。