杜 娜 ， 林 云 ， 劉淑敏 ， 牛 敏 ， 李亞波 ， 施雄飛 ， 周 芳 ， 堯 靜 ， 張孟爽 ，杜 艷

弗勞地枸櫞酸桿菌屬腸桿菌科細菌，是重要的醫(yī)院感染病原菌，可引起腹瀉、腦膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染[1]。臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌對碳青霉烯類耐藥最主要的機制是產碳青霉烯酶，主要包括KPC、VIM、IMP、OXA-48和NDM-1酶[2]。部分產NDM-1酶細菌會對除氨曲南外的幾乎所有抗菌藥物耐藥，僅剩替加環(huán)素和多黏菌素可用。已有報道表明質粒是介導blaNDM-1基因水平轉移的重要移動元件，但是這些發(fā)現大多集中在肺炎克雷伯菌[3]、大腸埃細菌[4]和鮑曼不動桿菌[5]，弗勞地枸櫞酸桿菌研究相對較少。本研究擬通過對18株產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌進行接合試驗、脈沖場凝膠電泳（PFGE）試驗及Southern印跡雜交試驗，明確blaNDM-1基因的水平轉移機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2012年6月－2014年10月產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌18株，經改良Hodge試驗、金屬酶（MBL）表型確證試驗以及聚合酶鏈反應（PCR）法檢測NDM-1酶及基因，通過 VITEK 2 進行菌株鑒定。菌株來源于尿液標本。包括移植中心12株，干療科3株，泌尿外科、神經外科、中醫(yī)科各1株。沙門菌 H9812 菌株由俞云松教授惠贈，質控菌大腸埃希菌ATCC 25922由本科室保存。

1.1.2 試劑 MH肉湯/瓊脂干粉購自英國OXOID公司，亞胺培南購自合肥博美生物科技有限公司，利福平購自北京酷來博科技有限公司，PCR所用試劑、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、5×TBE等購于天根（北京）科技有限公司，AgaroseⅢ膠購于美國Bio-Rad公司，蛋白酶K和Brij58購于美國Sigma公司，S1核酸內切酶購于美國Promega公司，尼龍膜購于美國Millipore公司，Southern印跡雜交試劑盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I購于美國Roche公司，枸櫞酸鈉、Tris、氯化鈉和低熔點膠等試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 VITEK 2全自動微生物鑒定與藥敏分析儀購自法國生物梅里埃公司，培養(yǎng)箱購自昆明友寧科技公司，1G603二級生物安全柜購自美國Baker公司，MyCycler TM thermalCycler DNA擴增儀、Power Pac3000型電泳儀、CHEF Mapper XA PFGE系統(tǒng)、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司，紫外分光光度計購自美國Thermo公司，分子雜交箱購自美國SHELLAB公司，水浴箱購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定及藥敏試驗 采用VITEK 2系統(tǒng)進行菌種鑒定及藥敏試驗。藥敏結果的判讀參照2014 年 CLSI M100-S24 標準。

1.2.2 接合試驗 供體菌為前期研究基礎上分離的產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌，受體菌為利福平耐藥的大腸埃希菌EC600。將供受體菌轉種于MH平皿上，37?℃過夜培養(yǎng)后挑取單個菌落接種于MH肉湯，37?℃過夜培養(yǎng)，將供、受體菌按1∶1比例加入MH肉湯混合靜置培養(yǎng)，37?℃過夜。將混合菌液和供、受體菌純菌液均接種在含4 mg/L 亞胺培南和256 mg/L利福平的MH平皿上，供受體純菌液不生長而混合菌液生長為接合子，再采用VITEK 2 兩對接合子進行菌種鑒定，菌種為大腸埃希菌者為接合子，最后再通過PCR驗證，擴增NDM-1基因陽性者為接合子。

1.2.3 PFGE分離質粒 取在MH平皿上純培養(yǎng)后的細菌調配菌液，紫外分光光度計測得的590 nm處吸光度值0.8～1.0為宜，將菌液與2%低熔點膠以1∶1比例進行細菌包埋。細菌包埋后用S1核酸酶在50 μL體系[ ddH2O 44.5 μL，10×buffer 5 μL，S1核酸酶（80 U/μL）0.5 μL ] 進行酶切，37?℃水浴箱中孵育2 h后進行PFGE。電泳條件：6 V/cm，脈沖時間2.16～63.8 s，14?℃，0.5×TBE緩沖液，電場角度120°，總時間為18 h。S1核酸酶可將染色體DNA降解而質粒DNA則消化成線性DNA，因而在PFGE圖譜中只能看見質粒DNA條帶，通過與Marker進行比對，讀取質粒的大小。

1.2.4 Southern印跡雜交試驗 ①探針的制備：選取1株經PCR確證為blaNDM-l基因陽性的菌株擴增。引物為F：5'-GGGCAGTCGCTTCCAACGGT-3'，R：5'-GATGTGCTCAGTGTCGGCAT-3'。擴增條件為：95?℃預變性5 min；95?℃ 30 s，63?℃30 s，72?℃ 45 s，35個循環(huán)；最后72?℃延伸3 min。反應體系為：總體積25 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master MIX 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定blaNDM-1基因片段。使用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對擴增產物進行切膠純化。使用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒中的DIG-High Prime進行DNA地高辛標記；②Southern印跡雜交：將PFGE膠上的DNA轉移至尼龍膜上，按照Southern印跡雜交試劑盒DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I進行操作。

2 結果

2.1 藥敏結果

18株細菌對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類抗生素的耐藥率高達 100%，對氨曲南、慶大霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星和呋喃妥因耐藥率分別為 66.7%（12株）、66.7%（12株）、66.7%（12株）、61.1%（11株）、61.1%（11株）、33.3%（6株）和 11.1%（2株）。接合子均對碳青霉烯類抗生素耐藥。

2.2 PFGE分離質粒

質粒條帶在PFGE圖上清晰可見，18株菌攜帶質粒的大小為33.3～310.1 kb，數目為1～5個。見圖1。

圖1 18株產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌經S1核酸酶酶切后的脈沖場凝膠電泳圖Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis patterns of S1-digested DNA of 18 Citrobacter freundii isolates

2.3 Southern印跡雜交

18株菌中有2株菌（15、16列）的blaNDM-1基因定位在33.3～54.7 kb大小的質粒上，其余菌株的blaNDM-1基因均位于約33.3 kb大小的質粒上。見圖 2。

3 討論

圖2 質粒與NDM-1探針的Southern印跡雜交圖Figure 2 Results of Southern blot hybridization between plasmid and NDM-1 probe

弗勞地枸櫞酸桿菌常寄生于人和動物腸道，廣泛分布于自然界及醫(yī)院環(huán)境中，是條件致病菌，可引起腹瀉、腦膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染。據中國醫(yī)院內病原菌耐藥性監(jiān)測網（NPRS） 顯示近年來在分離的腸桿菌科細菌中，枸櫞酸桿菌屬占較大比例。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，臨床分離的耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌不斷增加。NDM-1酶是2008年由Yong等[6]在1例感染肺炎克雷伯菌的印度裔瑞典患者的尿液標本中首次發(fā)現，此后在世界范圍內屢見報道。NDM-1酶常在肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌及陰溝腸桿菌中檢出，在弗勞地枸櫞酸桿菌中少見報道。2016年林迪等[7]報道了4株產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌，但是并未對blaNDM-1基因進行定位分析。本研究對18株產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌blaNDM-1基因定位于質粒進行了系統(tǒng)分析。

本研究藥敏結果顯示產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌以多重耐藥為顯著特點，除對碳青霉烯類、頭孢菌素類、青霉素類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物耐藥外，部分菌株還對氨曲南耐藥，而金屬β內酰胺酶不能水解氨曲南[8]，因此推測部分菌株中還存在其他β內酰胺酶介導對氨曲南的耐藥。接合試驗表明18株菌中有13株接合成功，blaNDM-1基因成功地從弗勞地枸櫞酸桿菌中轉移至大腸埃希菌，并呈現出碳青霉烯類抗生素耐藥表型，這初步表明blaNDM-1基因是位于接合質粒上，能通過質粒進行水平轉移。

碳青霉烯類耐藥基因常位于一些移動元件如質粒、整合子和插入序列共同區(qū)（ISCR）上，在同種屬或不同種屬細菌間穿梭，導致多重耐藥菌株的產生，給臨床抗感染治療帶來了極大困難。本組在前期研究中對產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌進行了克隆傳播研究及整合子和ISCR 1元件的檢測，結果表明產NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌克隆傳播趨勢不明顯，且blaNDM-1基因的傳播與整合子和ISCR1元件無關，但是在這兩種移動元件中檢出了氨基糖苷類和磺胺類抗菌藥物耐藥基因[9]。本研究繼續(xù)對質粒進行深入研究，在PFGE圖譜上可以清晰地看到每株菌中含有的質粒數目及大小都不一樣，但是有16株菌均含有一個約33.3 kb大小的質粒，通過Southern印跡雜交進行定位分析發(fā)現這16株菌的blaNDM-1基因均位于該質粒上，另外2株菌的blaNDM-1基因也位于質粒上，大小為33.3～54.7 kb。國內已有多個地區(qū)包括北京、上海、香港、山東、河南及云南等報道了blaNDM-1基因位于質粒上，質粒的大小為50～360 kb[10-11]，質粒的大小與我們的報道不一致。

“NDM-1超級細菌”已在世界范圍內播散，遏制此種細菌的傳播不僅需要多地區(qū)的合作，更需要醫(yī)院感染控制部門、微生物檢驗部門及臨床相關科室間的相互協作。本研究證明了耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌中的blaNDM-1基因是通過質粒進行水平傳播的，期望能為臨床抗感染治療及遏制產NDM-1酶細菌的傳播提供理論依據。