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(吉首大學林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室,湖南張家界 427000)

柚皮苷是一種二氫黃酮類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效,可用于合成甜味劑新橙皮苷和新橙皮苷二氫查耳酮[1]。自然界中,柚皮苷主要存在于蕓香科植物柚(CitrusparadisiMacfadyen)的果實中,其含量隨果實的膨大而快速下降,成熟后,92%的柚皮苷分布于果皮[2]。我國柚類品種繁多,在南方各地均有種植,菊花芯柚是湖南省張家界市永定區(qū)特有的品種,從實生柚樹芽變中選育,因果臍部有放射狀溝紋,似菊花形而得名[3]。有眾多學者對柚皮苷的提取制備方法進行了系統(tǒng)研究,例如,許有瑞等[4]采用乙醇熱回流提取沙田柚幼果,收率為26.04%;周強等[5]選擇堿提酸沉法提取柚皮,收率達1.82%,優(yōu)于常規(guī)浸提法;朱名毅等[6]采用50%乙醇輔助超聲提取沙田柚柚皮,收率達到6.14%。

雙水相萃取技術(shù)作為一種新型液/液萃取分離技術(shù),具有易于放大、可連續(xù)化操作、易集成技術(shù)和綠色環(huán)保等優(yōu)點[7]。經(jīng)過發(fā)展,雙水相體系的組成趨于多樣,其應(yīng)用已拓展到天然次生代謝產(chǎn)物分離領(lǐng)域。其中由乙醇或丙醇跟無機鹽組成的一類雙水相體系,輔助超聲波、微波或浮選技術(shù)后,能簡化分離工藝,提高分離效率,在天然活性成分分離中具有獨特的優(yōu)勢,應(yīng)用較多,比如,降香中鷹嘴豆芽素A[8]、丹參中紫草酸B[9]、金銀花中黃酮和糖[10]、木豆根中染料木素和芹菜素[11]、苦參中苦參堿和氧化苦參堿[12]、竹葉中葉綠素[13]。課題組關(guān)于醇/鹽雙水相體系進行了系統(tǒng)研究[14-15],采用乙醇/NaH2PO4雙水相萃取與超聲波、浮選技術(shù)聯(lián)用,實現(xiàn)了梔子[14]及杜仲葉[15]中環(huán)烯醚萜的提取分離,研究中通過繪制乙醇、正丙醇、異丙醇與NaH2PO4和(NH4)2SO4的雙水相體系相圖,發(fā)現(xiàn)乙醇、正丙醇和異丙醇的分相能力依次為:正丙醇>異丙醇>乙醇,正丙醇可以展現(xiàn)出相對較寬的分相范圍,通過無機鹽分相能力對比,發(fā)現(xiàn)NaCl不能作為分相鹽,K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4均能形成雙水相體系,其中分相能力最好的是(NH4)2SO4,能夠在鹽量較少的情況下分相。

本文選擇正丙醇和(NH4)2SO4用于構(gòu)建雙水相體系,輔助超聲波技術(shù),進行菊花芯柚皮中柚皮苷的提取工藝研究,并借助正交實驗確定最優(yōu)提取條件,研究成果實現(xiàn)了柚皮中柚皮苷提取和分離同步完成,提高了其分離效率,為雙水相萃取技術(shù)在天然二氫黃酮提取分離方面的應(yīng)用提供了借鑒,為柚皮苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù),為大量廢棄柚皮資源附加值的增加及利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花芯柚 采于湖南省張家界市永定區(qū)楓香崗菊花芯柚基地;柚皮苷對照品(批號:110722-201312,純度為94.7%) 中國食品藥品檢定研究院;正丙醇和(NH4)2SO4均為分析純;色譜甲醇 天津康科德科技有限公司;水 為去離子水。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(配G1311C四元梯度泵,G1315D DAD檢測器,G1316A柱溫箱和Agilent Chemstation B.04.03工作站) 美國安捷倫科技公司;DF-101C型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司;GZX-9146-MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;EASY15超純水儀 青島市力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;SB-25-12DT型超聲波清洗儀 寧波新藝生物科技股份有限公司;TDL-40B型離心機 上海安亭科學儀器廠;YB-2000A型高速多功能粉碎機 浙江永康市運邦工貿(mào)有限公司;AL204型萬分之一天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司;pH計 梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊花芯柚預(yù)處理 菊花芯柚剝皮,去除殘余果肉及果皮雜質(zhì),陰干,用粉碎機粉碎,過50目篩子,將過篩后的粉末置于60 ℃烘箱中干燥至恒重,并保存于干燥器中備用。

1.2.2 雙水相分相 利用小分子醇能跟一些無機鹽水溶液作用形成雙水相體系的機理,采用濁點法[14]繪制雙水相相圖,確定雙水相的分相范圍。濁點法操作步驟為:在錐形瓶中精密稱取一定量的無機鹽,加水溶解,配制成一定濃度無機鹽水溶液,然后用滴定管精密加入一定量的小分子醇,當溶液變渾濁時即為滴定終點,當醇或無機鹽的量加入過多時,無機鹽析出。

1.2.3 柚皮中柚皮苷的雙水相提取 選擇15 mL具塞PP 離心管作為提取器具,先用萬分之一電子天平精密稱取一定量的(NH4)2SO4無機鹽置于離心管,然后用移液管準確添加一定體積的去離子水,振蕩溶解后,再用移液管準確加入一定體積的正丙醇(根據(jù)密度換算成質(zhì)量),構(gòu)建總質(zhì)量為10.0 g的正丙醇/鹽雙水相體系,隨后,再準確稱取一定質(zhì)量的柚皮粉末加入到已構(gòu)建的10.0 g雙水相體系中,采用超聲波清洗儀在一定溫度和時間下提取;為促使雙水相體系分相徹底,提取結(jié)束后采用離心機以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,靜止后上下兩相界面清晰,殘渣全部集中于離心管底部。過濾后,將上下相溶液全部轉(zhuǎn)移到帶刻度的玻璃管內(nèi),分別記錄上、下相體積。

1.2.4 單因素實驗 實驗構(gòu)建的雙水相體系總質(zhì)量為10.0 g,包括正丙醇、(NH4)2SO4和水,采用單因素均分法依據(jù)1.2.3步驟,固定超聲波功率為240 W,研究(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)、正丙醇質(zhì)量分數(shù)、柚皮加入量、pH、超聲溫度及時間6個因素對柚皮中柚皮苷得率的影響。

1.2.4.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對柚皮苷得率的影響 固定正丙醇質(zhì)量分數(shù)為22%,30 ℃和30 min超聲條件下,調(diào)pH至5.0,加入0.10 g柚皮,考察(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)分別為14%、17%、20%、23%、26%時對柚皮苷得率的影響。

1.2.4.2 正丙醇質(zhì)量分數(shù)對柚皮苷得率的影響 固定(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為17%,30 ℃和30 min超聲條件下,調(diào)pH至5.0,加入0.10 g柚皮,考察正丙醇質(zhì)量分數(shù)分別為17%、20%、23%、26%、29%時對柚皮苷得率的影響。

1.2.4.3 柚皮加入量對柚皮苷得率的影響 固定正丙醇和(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)組成比例為20%/17%,30 ℃和30 min超聲條件下,調(diào)pH至5.0,考察柚皮加入量分別為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g時對柚皮苷得率的影響。

1.2.4.4 pH對柚皮苷得率的影響 固定正丙醇和(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)組成比例為20%/17%,30 ℃和30 min超聲條件下,柚皮加入量為0.20 g,考察pH分別為1、3、5、7、9時對柚皮苷得率的影響。

1.2.4.5 超聲溫度對柚皮苷得率的影響 固定正丙醇和(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)組成比例為20%/17%,30 min超聲時間下,柚皮加入量為0.20 g,考察超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時對柚皮苷得率的影響。

1.2.4.6 超聲時間對柚皮苷得率的影響 固定正丙醇和(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)組成比例為20%/17%,30 ℃超聲溫度下,柚皮加入量為0.20 g,考察超聲時間分別為10、20、30、40、50 min時對柚皮苷得率的影響。

1.2.5 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以雙水相上相中柚皮苷的得率(Y)為指標,選取對柚皮苷得率影響較大的(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)、正丙醇質(zhì)量分數(shù)、柚皮干粉加入量和pH4個因素作為考察因素,進行四因素三水平L9(34)正交試驗,優(yōu)化柚皮中柚皮苷提取工藝條件,采用軟件正交設(shè)計助手設(shè)計實驗方案,因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

1.2.6 超聲輔助雙水相提取柚皮苷含量的測定 柚皮干粉經(jīng)超聲輔助雙水相提取后,柚皮苷主要富集于上相,下相為鹽相。經(jīng)過0.45 μm有機膜過濾,進行HPLC檢測。

1.2.6.1 柚皮苷對照品溶液的配制和測定 按對照品使用要求將柚皮苷從安瓿瓶中快速取出,并精密稱取12.8 mg,放置于25 mL 容量瓶中,加入適量50%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,配成484.90 μg/mL 的柚皮苷對照母液。采用逐級稀釋法,用移液槍分別移取一定體積的對照母液于5 mL容量瓶,用50%甲醇稀釋定容,配制成質(zhì)量濃度分別為12.12、24.24、48.49、96.98、193.96 μg/mL對照品溶液,經(jīng)0.45 μm有機膜過濾后,進行HPLC檢測,并繪制標準曲線。

1.2.6.2 HPLC檢測方法 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相甲醇和0.1%磷酸水溶液的體積比為40∶60,檢測波長282 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量為20 μL。

1.2.6.3 柚皮苷得率的計算 通過得率來評價雙水相的提取效果,以上相中柚皮苷含量計算柚皮苷得率(Y),公式為:

式中:Ct為上相中柚皮苷的濃度(μg/mL),Vt為上相溶液的體積(mL),Md為柚皮干粉加入量(mg)。

1.2.7 雙水相提取放大實驗 依據(jù)最優(yōu)試驗點進行100倍放大研究,稱取180 g(NH4)2SO4于燒杯中,加610 g去離子水,充分溶解,然后添加210 g正丙醇,構(gòu)建1000 g雙水相體系,加15 g柚皮粉末,調(diào)pH至4.5,密封,40 ℃條件下,超聲波提取30 min。抽濾得濾液,靜止分相,進行HPLC檢測。

1.2.8 熱回流對比實驗 依據(jù)《中華人民共和國藥典2015版一部》枳殼中柚皮苷的提取方法作為參考,稱取柚皮干粉約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流1.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻即得,進行HPLC檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0版本進行正交實驗數(shù)據(jù)的方差分析和顯著性檢驗,采用EXCEL 2007進行圖表分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮苷測定及線性考察

按照“1.2.6.2項”下的色譜條件進行柚皮苷含量測定,柚皮苷對照(48.49 μg/mL)及最優(yōu)條件下柚皮苷在雙水相上、下相中的色譜圖見圖1。在對照品線性關(guān)系考察中,以質(zhì)量濃度為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y)繪制標準曲線,得回歸方程:Y=30717X+25.31(R2=0.9990),在質(zhì)量濃度為12.12～484.90 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系和精密度良好,加標回收率為99.20%。同時取48.49 μg/mL的對照品溶液,連續(xù)進樣6次,結(jié)果顯示柚皮苷保留時間的RSD為0.63%,峰面積的RSD為0.56%。

圖1 不同樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC analysis of samples obtained from various extraction steps注:A對照品,B上相,C下相。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的影響 實驗結(jié)果見圖2,隨著(NH4)2SO4用量的不斷加入,雙水相相比逐漸增大,柚皮苷得率整體呈現(xiàn)倒“V”型趨勢,在(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為17%時柚皮苷得率達到最大3.37%,當體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)增加時,柚皮苷得率變小,可能是由于水相中(NH4)2SO4含量增大,鹽的助溶作用增強,使得柚皮苷更易于富集于水相。所以后續(xù)研究選擇(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)的最佳點為17%。

圖2 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對柚皮苷得率的影響Fig.2 Effect of(NH4)2SO4 mass fraction for the yield of naringin

2.2.2 正丙醇質(zhì)量分數(shù)的影響 正丙醇具有良好的分相能力,是影響柚皮苷分離效率的關(guān)鍵因素。實驗結(jié)果見圖3,在正丙醇質(zhì)量分數(shù)由低到高變化過程中,柚皮苷得率呈現(xiàn)先變大后變小的趨勢,在質(zhì)量分數(shù)為20%時達到最大值3.31%,可能是由于隨著正丙醇含量的增大,一些脂溶性雜質(zhì)更多的溶出,影響了柚皮苷在上相的富集。所以選用20%(w/w)正丙醇雙水相體系進行后續(xù)研究。

圖3 正丙醇質(zhì)量分數(shù)對柚皮苷得率的影響Fig.3 Effect of 1-propanol mass fraction for the yield of naringin

2.2.3 柚皮干粉加入量的影響 柚皮中化學成分非常復(fù)雜,主要有柚皮苷、新橙皮苷及果膠等,為了進一步優(yōu)化柚皮苷的提取效果受料液比的影響,考察了柚皮干粉加入量的影響。實驗結(jié)果見圖4,柚皮干粉加入量在0.20 g,柚皮苷得率達到最大值3.47%,增大柚皮干粉,柚皮苷得率則下降明顯,最低至2.63%。可能是由于柚皮干粉加入量為0.20 g時,柚皮苷在上相中溶解達到飽和,隨著柚皮干粉加入量的增加,體系中果膠等雜質(zhì)也在增加,增加了固液分離的難度,減弱了雙水相體系的分離效果,導致柚皮苷得率下降。所以柚皮干粉加入量選用0.20 g。

圖4 柚皮干粉加入量對柚皮苷得率的影響Fig.4 Effect of sample loading for the yield of naringin

圖5 pH對柚皮苷得率的影響Fig.5 Effects of pH for the yields of naringin

2.2.5 超聲溫度的影響 輔助超聲波提取時,溫度是影響中藥活性成分的提取效率的一個重要因素。實驗結(jié)果見圖6,溫度由30～50 ℃變化時,柚皮苷得率變化不明顯,40 ℃時得率為3.80%,50 ℃時為3.82%,當溫度超過60 ℃后,柚皮苷的得率下降。柚皮中含有大量的果膠,溫度升高后,會促使果膠溶出,導致柚皮苷得率下降,實驗選用40 ℃作為提取溫度。

圖6 超聲溫度對柚皮苷得率的影響Fig.6 Effect of temperature for the yield of naringin

2.2.6 超聲時間的影響 時間同樣會影響雙水相提取柚皮苷的得率,實驗結(jié)果見圖7,在30 min時,柚皮苷得率達到最大值3.84%;超過30 min后,柚皮苷得率略有下降?？赡苁请S著時間延長,細胞中有更多雜質(zhì)溶出,影響雙水相的選擇性分配,導致柚皮苷得率下降。所以時間選用30 min。

圖7 時間對柚皮苷得率的影響Fig.7 Effect of time for the yield of naringin

2.3 正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.3.1 正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果 單因素實驗結(jié)果顯示,(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)(A)、正丙醇質(zhì)量分數(shù)(B)、柚皮干粉加入量(C)和pH(D)4個因素對柚皮苷得率有較大影響,因此選擇L9(34)正交表進行實驗,超聲溫度選擇40 ℃,時間設(shè)定30 min。由軟件正交試驗設(shè)計助手設(shè)計的實驗方案及結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果(n=3)Table 2 Design and results of L9(34)orthogonal tests(n=3)

2.3.2 正交實驗直觀分析 正交實驗直觀分析中因素極差值越大,則該因素對實驗結(jié)果的影響程度就越大,某一水平k值越大,則優(yōu)水平為該水平,根據(jù)表2數(shù)據(jù)的直觀分析,通過比較各個因素的k值和R值,可以看出影響柚皮苷得率的主次因素為:(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)(A)>pH(D)>柚皮粉加入量(C)>正丙醇質(zhì)量分數(shù)(B),最優(yōu)水平為A3D1C1B3,即最優(yōu)條件為:10.0 g雙水相體系中,(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%,正丙醇質(zhì)量分數(shù)為21%,柚皮干粉加入量為0.15 g,pH為4.5,超聲波提取溫度為40 ℃,時間為30 min。

2.3.3 正交實驗方差分析 選定4個因素,采用L9(34)正交表進行實驗,方案中無空白列用于統(tǒng)計實驗誤差,因此,分析通過重復(fù)試驗來統(tǒng)計實驗誤差,每個組合方案重復(fù)3次,共27組數(shù)據(jù)。采用SPSS 19.0軟件進行單變量有重復(fù)方差分析,結(jié)果見表3。依據(jù)各因素F值和顯著性水平判斷,因素(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)(A)、pH(D)和柚皮粉加入量(C)對柚皮苷得率的影響非常顯著,正丙醇質(zhì)量分數(shù)(B)影響顯著。

表3 正交實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal tests

2.3.4 驗證、放大及對比實驗 依據(jù)正交設(shè)計中最優(yōu)條件,10.0 g雙水相體系中,(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%,正丙醇質(zhì)量分數(shù)為21%,柚皮干粉加入量為0.15 g,pH為4.5,超聲波提取溫度為40 ℃,時間為30 min。進行驗證,3次平行實驗柚皮苷得率為4.27%,RSD為1.23%,表明該設(shè)計給的最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定可行,重復(fù)性良好。

依據(jù)“1.2.7”項進行放大研究,柚皮苷得率為4.25%,得率略小于驗證實驗,上相經(jīng)濃縮后,用50%乙醇水溶液溶解重結(jié)晶,得到柚皮苷約4 g,經(jīng)HPLC測量純度達到95%。依據(jù)“1.2.8”項進行柚皮的熱回流提取,柚皮苷得率為4.10%,小于4.27%,對比發(fā)現(xiàn),超聲輔助雙水相提取具有時間短、溫度低、能耗小、穩(wěn)定性好、得率高等優(yōu)點,效果優(yōu)于熱回流提取。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)研究了超聲波輔助正丙醇/(NH4)2SO4雙水相體系提取分離菊花芯柚果皮中柚皮苷的工藝條件。確定最優(yōu)提取工藝為:10.0 g雙水相體系中,正丙醇質(zhì)量分數(shù)為21%,(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%,柚皮干粉加入量為0.15 g,pH為4.5,超聲溫度40 ℃,時間為30 min,經(jīng)3次驗證實驗后,柚皮苷得率為4.27%,RSD為1.23%,依據(jù)最優(yōu)條件進行100倍放大研究,經(jīng)HPLC檢測,柚皮苷得率為4.25%,與傳統(tǒng)熱回流提取方法對比發(fā)現(xiàn),超聲輔助雙水相提取具有時間短、溫度低、能耗小、穩(wěn)定性好、得率高等優(yōu)點,優(yōu)勢明顯。該工藝具有操作簡單、成本低廉、設(shè)備要求低、易放大生產(chǎn)等優(yōu)點,為工業(yè)制備柚皮苷提供了一定理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。