唐 浪,舒 梨,趙興秀,趙長青

(四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

正丙醇作為白酒發(fā)酵過程中的高沸點副產物,是白酒中的一種香氣物質[1],也是白酒中苦味的主要來源之一[2],其含量過高不但影響白酒的品質,還會影響人體神經(jīng)系統(tǒng)[3]。我國國標GB/T 10343-2002《食用酒精》中對其在食用酒精中的含量做了規(guī)定(≤100 mg/L)[4]。如何降低食用酒精中正丙醇的含量,提高食用酒精質量,是制酒行業(yè)不可避免的問題,極具研究意義。

傅其軍等[5]研究了食用酒精的酒度和生產過程中精餾塔底溫與正丙醇含量的關系,并在生產中做出了相應優(yōu)化。謝文華[6]研究了正丙醇的性質和來源,并通過調整發(fā)酵液組成、優(yōu)化提取工藝等方法降低食用酒精中正丙醇的含量,提高了食用酒精質量。羅惠波等[7]采用模擬固態(tài)發(fā)酵的方法,通過減少水用量、加糠量以及投糧量,增大加曲量,可降低白酒中正丙醇含量。張翠英等[8]把低產正丙醇優(yōu)勢釀酒酵母工程菌應用在小曲酒的釀造中,達到了降低小曲酒中正丙醇含量的目的?？梢?目前相關領域研究主要體現(xiàn)在白酒生產設備改進、發(fā)酵工藝優(yōu)化以及優(yōu)選釀酒酵母等方面。而將優(yōu)勢功能芽孢桿菌應用至白酒發(fā)酵以降低白酒中正丙醇含量的研究,則鮮有報道。

針對這一領域研究的不足,本課題組在之前的試驗中從濃香型白酒釀酒大曲和糟醅中分離出了低產正丙醇的功能芽孢桿菌—蠟質芽孢桿菌(Bacilluscereus)[9]。在這一基礎上,本研究通過單因素實驗和響應面法對該B.cereus發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化,以期進一步降低B.cereus發(fā)酵過程中產生的正丙醇含量,為將B.cereus應用至濃香型白酒傳統(tǒng)釀造工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質芽孢桿菌(B.cereus)本實驗室分離和保存,用于蘇氨酸液體發(fā)酵;乙酸丁酯、正丙醇 色譜純,天津市光復精細化工所;無水乙醇 優(yōu)級純,成都市科隆化學品有限公司;蛋白胨酵母膏、瓊脂、巴豆酸 分析純,成都市科隆化學品有限公司。

Agilent 7890A型氣相色譜儀 美國Agilent公司;DPH-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上?；厶﹥x器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基[10]:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;

種子培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;

蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基[11]:葡萄糖30 g,酵母膏1 g,氯化鈉6 g,巴豆酸2 g,蘇氨酸2.5 g,蒸餾水1000 mL,115 ℃滅菌30 min。

1.2.2 種子液的制備 將保存于斜面培養(yǎng)基中的B.cereus取出,接種于LB固體培養(yǎng)基上進行平板劃線,置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h,以此操作純化3次,并接種斜面于4 ℃保存。將菌株從斜面上取一環(huán)至100 mL已滅菌的種子培養(yǎng)基中,置于37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng),后將其菌落數(shù)稀釋為107CFU/mL,作為種子液備用。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調為8.0,按5%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),于37 ℃下分別發(fā)酵24、36、48、60、72 h。發(fā)酵結束后,測定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.3.2 接種量對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調為8.0,分別按1%、2.5%、5%、7.5%、10%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),于37 ℃下發(fā)酵36 h。發(fā)酵結束后,測定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調為8.0,按5%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),分別于22、27、32、37、42 ℃下發(fā)酵36 h。發(fā)酵結束后,測定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.3.4 發(fā)酵液初始pH對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別調為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按5%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),于32 ℃下發(fā)酵36 h。發(fā)酵結束后,測定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上,選取發(fā)酵時間(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵液初始pH(D)作為響應變量,以正丙醇含量為響應值,采用Box-Behnken試驗設計方法,試驗因素水平設計見表1[12-14]。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 正丙醇的測定方法 色譜條件:色譜柱為DB-WAX(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱,進樣口溫度210 ℃,檢測器溫度230 ℃;柱箱升溫程序:起始40 ℃,保持1 min,6 ℃/min升至180 ℃保持2 min,10 ℃/min升至220 ℃,保持5 min,運行時間35 min;載氣:N2,N2∶H2=80∶20,載氣流量:5 mL/min,載氣壓力:0.08 MPa,進樣量1 μL。

標準溶液的配制:分別準確吸取乙酸丁酯、正丙醇色譜純標準試劑2 mL于100 mL容量瓶中,用體積分數(shù)為50%的乙醇(超純水稀釋無水乙醇得到)定容至100 mL,體積分數(shù)為2%。準確吸取體積分數(shù)為2%的各標準溶液各3 mL于25 mL容量瓶,用50%乙醇溶液定容至刻度,用于建立系統(tǒng)模板和計算校正因子。

模板建立和校正因子的計算:根據(jù)各種物質在同一色譜柱和相同儀器條件下有確定不變的保留值,因此可以定性混合標準液中各種成分,確定其出峰順序。取混合標準液1 μL進樣色譜分析,進樣2次,確定出峰順序,定性混合標準液中各種成分。出峰順序依次為正丙醇、乙酸丁酯(內標)。校正因子=內標物峰面積×標準物質濃度/內標物濃度/標準物質峰面積。

發(fā)酵液測定:發(fā)酵液放入高速離心機中,6000 r/min離心6 min,取上清液過0.45 μm濾膜后備用。取離心后的發(fā)酵液1.5 mL,加入體積分數(shù)為2%的標準內標物(乙酸丁酯)0.15 mL,內標物濃度為146.109 mg/100 mL?；靹蚝?再與f值相同條件下測定。正丙醇濃度=校正因子×正丙醇峰面積×內標物質量濃度/內標物峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)處理采用美國Microsoft Corporation公司的Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)分析并制成柱狀圖;響應面試驗數(shù)據(jù)處理采用美國Stat Ease公司的Design-Expert 8.0.6軟件,統(tǒng)計差異比較采用軟件中的方程顯著性檢驗操作,通過方差分析檢驗(p<0.05)模型及因素的顯著性。所有實驗重復3次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 校正因子

如表2所示,混合標準樣品(正丙醇、乙酸丁酯)中兩種成分相對標準偏差(RSD)<5%,校正因子可靠,適用于香氣成分定量分析[15-17]。

表2 混合標準液的校正因子Table 2 Correction factors for the mixed standard solution

2.2 色譜分析

圖1是混合標準樣品(正丙醇、乙酸丁酯)的氣相色譜離子流色譜圖。由圖1可知,兩種混合標準樣品的溶液離子流色譜出峰清楚,因此是可信的。

圖1 混合標準溶液離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution注：1：正丙醇；2：乙酸丁酯。

2.3 單因素實驗

2.3.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖2可知,隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵液中正丙醇含量先降低后升高。這是因為24 h之前,發(fā)酵處于起始階段,B.cereus在生長和增殖過程中產生了一定的正丙醇,導致正丙醇較多。24～48 h時,發(fā)酵液糖分及其它營養(yǎng)物質充足,B.cereus代謝良好,相應正丙醇的產生受到抑制,之前產生的正丙醇又被利用分解,正丙醇含量較低[18]。48 h之后細菌老化,營養(yǎng)物質缺乏,正丙醇逐漸積累。故選擇發(fā)酵時間24、36和48 h作為響應面試驗的優(yōu)化水平。

圖2 發(fā)酵時間對發(fā)酵液中正丙醇含量影響Fig.2 Effect of fermentation time on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.3.2 接種量對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖3可知,隨著接種量的增加,發(fā)酵液中正丙醇含量逐漸降低。這是因為接種量的增加使得B.cereus繁殖加快,發(fā)酵液的糖分消耗加快,加速了發(fā)酵的完成,從而避免了正丙醇的積累,所以接種量的增大有利于低產正丙醇。但是考慮到實際運用到白酒發(fā)酵時,過多接種B.cereus會嚴重影響白酒的口感,是不可取的[19]。故選擇接種量2.5%、5%和7.5%作為響應面試驗的優(yōu)化水平。

圖3 接種量對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響Fig.3 Effect of inoculation amount of B. cereus on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵液中正丙醇含量逐漸升高。這是因為發(fā)酵溫度升高會加強蛋白質分解和促進正丙醇的生成。但是過低的發(fā)酵溫度會導致B.cereus活性不足,不利于它的正常繁殖和代謝。當實際運用到白酒發(fā)酵時就會延長白酒發(fā)酵的主發(fā)酵期,還會抑制其它香味物質的產生,進而影響白酒的品質[20]。故選擇發(fā)酵溫度為27、32、37 ℃作為響應面試驗的優(yōu)化水平。

圖4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.3.4 發(fā)酵液初始pH對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖5可知,隨著發(fā)酵液初始pH的升高,發(fā)酵液中正丙醇含量先降低后升高。這是因為酸性和堿性條件下B.cereus的正常代謝受到抑制,但是細菌體內產正丙醇的相關酶卻還具有相當?shù)幕钚?它們促進了正丙醇的產生,導致發(fā)酵液中正丙醇的積累[21]。中性條件下代謝正常,正丙醇的產生也受到抑制,發(fā)酵液中正丙醇含量較低。故選擇pH為6.0、7.0和8.0作為響應面試驗優(yōu)化水平。

圖5 發(fā)酵液初始pH對發(fā)酵液中正丙醇濃度影響Fig.5 Effect of initial pH of fermentation broth on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.4 響應面優(yōu)化

響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface test

將試驗數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件進行多元擬合,得到了以正丙醇含量為目標函數(shù)的回歸方程:Y(正丙醇含量)=0.88-0.10A+0.009B-0.018C-0.021D+0.25AB+0.005AC-0.18AD-0.033BC+0.15BD-0.22CD+0.76A2+0.52B2+0.46C2+0.61D2

響應面回歸模型的方差分析見表4。

表4 正丙醇含量響應面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the response surface regression model of the concentration of n-propyl alcohol

此外,顯著性檢驗表明,對正丙醇含量的影響次序為:A(發(fā)酵時間)>D(發(fā)酵液初始pH)>C(發(fā)酵溫度)>B(接種量)。另外,A發(fā)酵時間和B接種量的交互項、A發(fā)酵時間的二次項、B接種量的二次項、C發(fā)酵溫度的二次項、D發(fā)酵液初始pH的二次項對正丙醇含量的影響極顯著(p<0.001);A發(fā)酵時間和D發(fā)酵液初始pH的交互項、C發(fā)酵溫度和D發(fā)酵液初始pH的交互項對正丙醇含量影響高度顯著(p<0.01);A發(fā)酵時間、B接種量和D發(fā)酵液初始pH的交互項對正丙醇含量影響顯著(p<0.05);其它因素對正丙醇含量的影響不顯著(p>0.05)。

根據(jù)回歸方程得到不同因子對正丙醇含量的響應面結果見圖6。圖6直觀地給出了各個因子交互作用的響應面3D圖和等高線分析圖。響應面3D圖曲面坡度陡峭程度越大對應兩因素對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響就越大[22]。此外,等高線形狀也反映了因素之間交互作用的強弱,橢圓程度越高表示兩因素交互作用越顯著,反之表示交互作用不明顯[23]。通過響應面陡峭程度分析發(fā)現(xiàn),A(發(fā)酵時間)對正丙醇含量的影響最大,其次是D(發(fā)酵液初始pH)和C(發(fā)酵溫度),B(接種量)對正丙醇含量的影響最小。通過等高線分析發(fā)現(xiàn)AB、AD、BD、CD交互作用對應等高線均為橢圓形,說明各因素交互作用均顯著(p<0.05),進一步分析其橢圓程度,得到各因素交互對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響程度為:AB>CD>AD>BD。與表4方差分析結果一致。

圖6 各因素互交對發(fā)酵液中正丙醇含量的影響Fig.6 Effect of the intercross of various factors on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.5 驗證實驗

依據(jù)建立的響應面模型,以正丙醇含量最低為優(yōu)化條件,得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時間32.96 h,接種量4.92%,發(fā)酵溫度32.15 ℃,發(fā)酵液初始pH7.04,得到正丙醇含量的預測值為0.69 mg/100 mL,考慮到實際操作的便捷性,將該工藝條件簡化為發(fā)酵時間33 h,接種量4.9%,發(fā)酵溫度32 ℃,發(fā)酵液初始pH7.0。按照該簡化條件進行3次重復試驗,所得發(fā)酵液中正丙醇含量為(0.70±0.0012) mg/100 mL,吻合度達到98.6%,說明該模型很好地預測了B.cereus低產正丙醇發(fā)酵工藝條件。

3 結論與討論

依據(jù)建立的響應面模型,以正丙醇含量最低為優(yōu)化條件,結合實際情況,得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時間33 h,接種量4.9%,發(fā)酵溫度32 ℃,發(fā)酵液初始pH7.0,此時,發(fā)酵液中正丙醇含量為(0.70±0.0012) mg/100 mL,吻合度達到預測值的98.6%,說明該模型很好地預測了B.cereus低產正丙醇發(fā)酵工藝條件。

白酒釀造過程中功能菌影響著窖泥微生物生態(tài)功能及酒糟發(fā)酵生態(tài),從而決定著白酒的質量和風格[24]。在濃香型白酒的釀造中,釀酒微生物群中的蠟質芽孢桿菌作為一種重要的功能菌而存在,它影響著正丙醇在內的多種香味物質的產生[25]。因此本文基于從濃香型白酒釀酒大曲中篩選出的低產正丙醇B.cereus,通過單因素實驗,運用響應面法優(yōu)化得到了最優(yōu)發(fā)酵工藝。該發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵液中正丙醇含量符合中國國標優(yōu)級酒要求[26]。如果將該B.cereus及發(fā)酵工藝條件應用至濃香型白酒傳統(tǒng)釀造工藝,將有利于提高濃香型白酒品質。