李 倩,趙 剛,闞秀芳

(長(zhǎng)春市第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第二位，是男性腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因[1]。雄激素(androgen)和雄激素受體(androgen receptor,AR)通路激活在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。 因此，以降低血清雄激素水平和拮抗AR為目的的雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy,ADT)是治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的主要手段，該療法能夠使80%-90%的患者緩解并提高總體生存率。但經(jīng)過(guò)12-18個(gè)月的ADT后，超過(guò)80%的患者會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)[2,3]。CRPC患者的總體生存率平均僅為23-37個(gè)月[4]。

前列腺癌發(fā)展成 CRPC的原因是雄激素通路的再活化。一方面是由于AR過(guò)表達(dá)、突變、變異體和翻譯后修飾，導(dǎo)致AR信號(hào)非配體依賴性激活；另一方面是由于腫瘤自身獲得合成雄激素的能力，其中睪酮(testosterone,T)與二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)可有力促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。醛酮降解酶家族1成員3(aldo-keto reductase family 1 member 3,AKR1C3)是前列腺癌細(xì)胞自身合成睪酮與二氫睪酮的關(guān)鍵酶。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的AKR1C3表達(dá)可適應(yīng)T/DHT剝奪[5]；在PC-3細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)AKR1C3可促進(jìn)血管生成并增強(qiáng)細(xì)胞侵襲性[6]。然而，AKR1C3的表達(dá)水平與前列腺癌進(jìn)展之間的關(guān)系尚不明確。本研究使用46例人前列腺穿刺組織樣本，檢測(cè)其AKR1C3表達(dá)水平，并分析AKR1C3表達(dá)水平與前列腺癌Gleason評(píng)分之間的關(guān)系，探究AKR1C3是否可作為評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)程的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來(lái)源

選用的前列腺良性病變4例及前列腺癌42例樣本來(lái)自于2010-2016年間長(zhǎng)春市第二醫(yī)院，所有患者之前均未接受過(guò)前列腺癌根治性切除手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療以及激素治療等。其中前列腺癌為腺癌，樣本的Gleason評(píng)分大于等于6。所用前列腺癌樣本的臨床資料見(jiàn)表1。2位經(jīng)驗(yàn)豐富的泌尿外科病理學(xué)家負(fù)責(zé)本項(xiàng)目所用標(biāo)本的病理學(xué)診斷。

表1 前列腺癌樣本臨床資料

與良性增生比較，*P<0.05，**P<0.01

1.2 試劑

鼠抗AKR1C3單克隆抗體購(gòu)自Abcam，二步法免疫組化用二抗及DAB顯色試劑盒為北京中杉生物公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

前列腺組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟包埋，切成4 m的薄片，70℃烘烤過(guò)夜。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后經(jīng)分級(jí)乙醇水化，切片置于0.5% H2O2中孵育10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，于含10 mM檸檬酸緩沖液(pH 6.0)的高壓鍋中120℃加熱15 min修復(fù)抗原，用pH 7.6的0.1 M PBS洗片5 min，與含10%山羊血清共同孵育以封閉非特異性抗原。將切片與1∶00稀釋的鼠抗AKR1C3單克隆抗體于4℃孵育過(guò)夜。PBS洗片后，與生物素化的山羊抗-鼠二抗室溫孵育1 h。PBS洗片10 min后，切片與DAB-H2O2底物室溫孵育6 min。蒸餾水洗片，蘇木精復(fù)染。然后將切片脫水，樹(shù)脂封片。陰性對(duì)照組中，以磷酸緩沖液替代一抗。

1.4 結(jié)果判定

AKR1C3的陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為棕色的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核染色。每張組織切片中隨機(jī)選取5個(gè)AKR1C3陽(yáng)性區(qū)域(400×,放大率)。以IPP 6.0軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的密度值進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果以平均光密度值(MOD)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果均經(jīng)SPSS 17.0 軟件處理。單因素方差分析評(píng)價(jià)組間平均差異，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式記錄。斯皮爾曼R值測(cè)試變量之間的聯(lián)系。P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 AKR1C3在人前列腺增生樣本中的表達(dá)

在本研究中，我們通過(guò)免疫組化技術(shù)對(duì)人前列腺樣本(前列腺良性增生、前列腺癌)中的AKR1C3進(jìn)行染色，組織切片中免疫組化棕色染色部分為 AKR1C3陽(yáng)性。磷酸鹽緩沖液對(duì)照組細(xì)胞為陰性染色，正常腺上皮組織與前列腺良性增生組織內(nèi)可見(jiàn)散在的免疫組化陽(yáng)性染色(圖1)，而前列腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)廣泛陽(yáng)性染色(圖2)。而且前列腺良性增生與前列腺癌組織內(nèi)AKR1C3的表達(dá)分布存在差異。在前列腺良性增生組織內(nèi)，AKR1C3陽(yáng)性細(xì)胞多集中于基質(zhì)，而在惡性前列腺癌組織，上皮細(xì)胞內(nèi)AKR1C3陽(yáng)性細(xì)胞比例增加。而且在前列腺癌細(xì)胞內(nèi)，隨著Gleason評(píng)分的增高，AKR1C3表達(dá)也增強(qiáng)。這一結(jié)果提示，AKR1C3的表達(dá)水平與前列腺癌和Gleason評(píng)分緊密相關(guān)。

圖1 正常前列腺上皮及前列腺增生組織中AKR1C3的表達(dá)

2.2 AKR1C3與前列腺癌穿刺樣本臨床病理特征之間的關(guān)系

Gleason評(píng)分是評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)展的重要指標(biāo)，因此我們分析AKR1C3表達(dá)水平與Gleason評(píng)分之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示，隨著Gleason評(píng)分的升高，AKR1C3的表達(dá)水平(MOD值)逐漸升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(rs= 0.325,P=0.031)。這一結(jié)果提示，AKR1C3可反映前列腺癌的臨床病理特征與進(jìn)展(表2)。

圖2 前列腺癌組織中AKR1C3的表達(dá)

Gleason評(píng)分nAKR1C3(MOD) 前列腺增生414.15±11.50前列腺癌 G=61227.18±12.50 G=7937.96±17.86* G=8941.42±13.46** G=9953.62±12.30** G=10364.64±20.83**

與良性增生比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

目前關(guān)于前列腺癌進(jìn)展的機(jī)制尚未闡明，但是雄激素信號(hào)通路再活化的兩個(gè)機(jī)制已被廣泛關(guān)注[7]。一是通過(guò)AR的過(guò)表達(dá)或突變，激活A(yù)R信號(hào)通路[8,9]；二是腫瘤細(xì)胞利用膽固醇從頭合成雄激素或加快腎上腺皮質(zhì)激素的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而激活A(yù)R信號(hào)通路[10,11]。有研究發(fā)現(xiàn)，ADT可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)激素代謝酶活性上調(diào)，尤其是生成雄激素的關(guān)鍵酶AKR1C3。與正常前列腺組織和原位癌相比，骨轉(zhuǎn)移癌和CRPC腫瘤樣本中AKR1C3表達(dá)均顯著增加[12]。而且AKR1C3表達(dá)增加與雄激素水平降低、去雄激素培養(yǎng)后前列腺癌細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[9]，提示AKR1C3過(guò)表達(dá)可能是前列腺癌由激素依賴性向CRPC轉(zhuǎn)化、前列腺癌中腫瘤干細(xì)胞調(diào)控復(fù)發(fā)的適應(yīng)性變化。然而，AKR1C3表達(dá)水平與前列腺癌進(jìn)展之間的關(guān)系尚不清楚。

在正常前列腺組織，基質(zhì)細(xì)胞分泌的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)等維持上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化[13]。在前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，惡變的上皮細(xì)胞適應(yīng)性地獲得雄激素自分泌能力，以維持腫瘤細(xì)胞自身的生長(zhǎng)。在前列腺癌向去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)進(jìn)展的過(guò)程中，AKR1C3作為關(guān)鍵酶，可催化Δ4-二酮和脫氫表雄酮(DHEA)轉(zhuǎn)變?yōu)椴G酮，5α-雙氫睪酮(5α-DHT)轉(zhuǎn)變?yōu)?α-二醇與雄烯二酮。在這一過(guò)程中，與合成雙氫睪酮(DHT)相比，AKR1C3更傾向于通過(guò)旁路途徑合成睪酮[14]。這些研究提示，AKR1C3過(guò)表達(dá)可能是維持腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的適應(yīng)性改變。

為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，在本研究中，我們利用免疫組化染色的方法檢測(cè)不同Gleason評(píng)分的前列腺癌穿刺樣本中AKR1C3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著Gleason評(píng)分的提高，AKR1C3的表達(dá)水平逐漸升高，提示AKR1C3的過(guò)表達(dá)水平與前列腺癌的惡性程度緊密相關(guān)。而且前列腺癌與良性病變組織中，AKR1C3的表達(dá)分布存在差異。在前列腺良性增生組織內(nèi)，AKR1C3表達(dá)主要集中在基質(zhì)細(xì)胞，在Gleason評(píng)分>6的惡性前列腺癌組織內(nèi)，AKR1C3的表達(dá)主要集中于上皮細(xì)胞。 這一結(jié)果提示，AKR1C3可成為評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)展的分子標(biāo)志。