李 志，冷 峰，楊婷婷，李文哲，王 波，薛邦祿

(1.大連市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 遼寧 大連116044)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種兒童常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，發(fā)病率多年來一直保持著上升。最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，支氣管哮喘患兒發(fā)病率逐年升高，總發(fā)病率與10年前相較升高了43.4%，與20年前相較升高了147.9%[1,2]。由于小兒支氣管哮喘的病理過程非常復(fù)雜，尚無十分明確的發(fā)病機(jī)制，最常見的是由IgE作為媒介傳導(dǎo)而產(chǎn)生的氣道變態(tài)性反應(yīng)，除此之外還和神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌環(huán)境、精神和遺傳學(xué)等因素密切相關(guān)。

在傳統(tǒng)的變態(tài)反應(yīng)型支氣管哮喘中，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能異常為哮喘發(fā)作的主要因素，Th1/Th2細(xì)胞之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致的Th2細(xì)胞占據(jù)主要地位被認(rèn)為是最為經(jīng)典[3]。除了傳統(tǒng)上的CD4+初始T細(xì)胞亞群：Th1、Th2、Treg和Th17等細(xì)胞外，近年來，多種新型CD4+T細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步完善了Th1/Th2平衡失調(diào)理論。國內(nèi)外學(xué)者通過大量研究從而發(fā)現(xiàn)多種輔助性T細(xì)胞均參與兒童支氣管哮喘的病理過程并在其中扮演著重要角色。CD4+初始T細(xì)胞在IL-4與TGF-β共同存在的情況下能夠產(chǎn)生一種IL-9+IL-10+Foxp3-的T細(xì)胞，即Th9細(xì)胞。Th9細(xì)胞主要分泌的IL-9在支氣管哮喘的呼吸道炎癥中能夠提高IgE的分泌量，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性的發(fā)生，在細(xì)胞的分化、增殖、細(xì)胞間信息傳達(dá)等方面都存在重要調(diào)節(jié)意義。Th22細(xì)胞是一種和Th17、Th9等細(xì)胞都不同的獨(dú)立Th細(xì)胞，不同的炎癥介質(zhì)和Th22細(xì)胞的配體依賴轉(zhuǎn)錄因子AHR能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群對IL-22的表達(dá)。IL-22可以增強(qiáng)呼吸道修復(fù)上皮功能，縮小哮喘患者炎癥范圍，從而保護(hù)肺部組織、減輕支氣管炎癥。

本研究主要通過檢測支氣管哮喘患兒的外周血Th9和Th22細(xì)胞的比例以及血清中IL-9、IL-22和總IgE的表達(dá)，并分析這些細(xì)胞及其細(xì)胞因子與哮喘嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，進(jìn)一步的討論Th9和Th22細(xì)胞在哮喘臨床診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2016年1月至2017年3月在大連市中心醫(yī)院就醫(yī)的哮喘患兒56例，依據(jù)哮喘患兒發(fā)病的嚴(yán)重程度分為兩組：哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組。哮喘的診斷均符合2016年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中，哮喘發(fā)作組共32例，男15例，女17例，年齡3-14歲，平均(6.65±2.57)歲；哮喘緩解組共24例，男9例，女15例，年齡3-12歲，平均(5.49±2.18)歲。另選20例健康兒童作為健康對照組，其中男12例，女8例，年齡3-12歲，平均(5.9±2.31)歲。所有兒童一個(gè)月內(nèi)均未使用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，經(jīng)檢查排除患有肺部疾病的可能并排除合并腎小球腎炎及鼻炎、蕁麻疹等變態(tài)反應(yīng)性疾病史和其他相關(guān)慢性疾病。三組對象在一般臨床資料方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑

FITC標(biāo)記-抗人CD4單克隆抗體、IntraPrepTM固定劑和破膜劑購自美國Beckman公司；PE標(biāo)記-抗人IL-9抗體、PE標(biāo)記-抗人IL-22抗體及同型對照IgG1-PE購自美國Affymetrix e-Bioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液、RPMI-1640培養(yǎng)基、佛波醇酯類多克隆刺激劑(PMA)、鈣離子載體離子霉素(Ionomycin)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻抑劑莫能霉素(monensin)購自美國Sigma-Aldrich公司；人IL-9和IL-22 ELISA定量試劑盒購自美國R&D公司。

1.2.2主要儀器設(shè)備

流式細(xì)胞儀：CytomicsTMFC 500；特定蛋白分析儀：IMMAGE 800，購自美國Beckman公司。Sunrise酶標(biāo)儀：購自奧地利Tecan公司。

1.3 標(biāo)本采集和處理

采集受檢者清晨空腹靜脈血各3 ml于EDTA抗凝管和促凝管中，所有標(biāo)本均來自于臨床診斷所用標(biāo)本，無乳糜或溶血現(xiàn)象。

1.3.1分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs) 在無菌離心管中加入適量的人淋巴細(xì)胞分離液，將磷酸鹽緩沖液(PBS)與抗凝血1∶1混合稀釋，沿管壁緩慢加于分離液上。經(jīng)2 000 r/min離心20 min后，用毛細(xì)吸管從中間吸取單個(gè)核細(xì)胞，置入事先準(zhǔn)備好的離心管中。

1.3.2分離血清 待促凝管中血液凝固后，經(jīng)3 000 r/min離心5 min，取上層血清分為兩份，一份送至檢驗(yàn)科免疫室檢測血清總IgE的含量，另一份置于-70℃冰箱冷凍保存用于ELISA試驗(yàn)檢測細(xì)胞因子IL-9和IL-22的含量。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1Th9和Th22細(xì)胞的流式檢測

(1) 重懸細(xì)胞：在分離出的PBMCs中加入PBS，經(jīng)1 500 r/min離心10 min，洗滌細(xì)胞兩次。末次洗滌后，棄上清，重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素)。

(2) 胞外染色：根據(jù)單抗試劑說明，在收集的細(xì)胞內(nèi)加入CD4-FITC單抗，混勻后避光孵育20 min。

(3) 細(xì)胞培養(yǎng)：將染色后的PBMCs懸液加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，每孔1 mL，培養(yǎng)孔中加入終濃度為50 μg/L PMA、離子霉素1 μg/mL、3 μmol/L莫能霉素的混合液。將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/mL，置入37℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育。4 h后取1 ml細(xì)胞懸液至流式管中，2 000 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗2次。

(4) 固定破膜：洗滌后的細(xì)胞懸液用試劑IntraPrepTM進(jìn)行固定和破膜。加固定劑500 μl，振蕩后避光孵育15 min，加PBS離心洗滌，棄上清，加破膜劑500 μl，輕輕混勻，避光孵育5 min。

(5) 胞內(nèi)染色：將破膜后的懸液經(jīng)PBS洗滌2次后平均分成4管，分別加入IL-9-PE、IL-22-PE和同型對照IgG1-PE各10 μl，避光孵育30 min，PBS洗滌2次后加入500 μl的PBS重懸。

(6) 流式檢測：應(yīng)用CytomicsTM FC 500流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記的各淋巴細(xì)胞胞膜及細(xì)胞因子的熒光強(qiáng)度，界定CD4+IL-9+為Th9細(xì)胞，CD4+IL-22+為Th22細(xì)胞。

1.4.2特定蛋白分析儀檢測血清中總IgE的含量

分離出的血清采用IMMAGE 800特定蛋白分析儀以及相應(yīng)的配套原裝試劑進(jìn)行上機(jī)檢測總IgE含量。

1.4.3ELISA檢測血清中IL-9和IL-22的含量

嚴(yán)格按照各ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行操作。在450 nm波長下，用酶標(biāo)儀測定實(shí)驗(yàn)血清中細(xì)胞因子IL-9和IL-22及各標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，計(jì)算出血清中IL-9和IL-22濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用流式細(xì)胞儀所測得的Th9和Th22細(xì)胞所占細(xì)胞百分比以及用ELISA試劑盒所測得的血清中IL-9和IL-22的濃度，均采用SPSS 22.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“x—±s”表示，兩組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行直線相關(guān)性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支氣管哮喘患兒外周血中Th9和Th22細(xì)胞的表達(dá)

哮喘發(fā)作組患兒外周血中Th9和Th22細(xì)胞表達(dá)比例與哮喘緩解組、健康對照組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。哮喘緩解組患兒外周血中Th9和Th22細(xì)胞表達(dá)比例與健康對照組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組兒童外周血中Th17、Th9和Th22細(xì)胞表達(dá)比例

注：a：與哮喘緩解組、健康對照組相比，P<0.05；b：與健康對照組相比，P<0.05

2.2 支氣管哮喘患兒血清中IL-9、IL-22和總IgE的水平

哮喘發(fā)作組患兒血清中IL-9、IL-22和總IgE的水平與哮喘緩解組、健康對照組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。哮喘緩解組血清中IL-9、IL-22和總IgE的水平與健康對照組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組兒童血清中IL-17、IL-9、IL-22和總IgE的含量

注：a：與哮喘緩解組、健康對照組相比，P<0.05；b：與健康對照組相比，P<0.05

2.3 支氣管哮喘患兒血清中IL-9、IL-22與總IgE水平相關(guān)性分析

在哮喘發(fā)作組中，支氣管哮喘患兒血清中IL-9、IL-22與總IgE水平均呈正相關(guān)(r=0.491，r=0.786，P值均<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 支氣管哮喘患兒血清中IL-9與總IgE水平呈正相關(guān)

圖2 支氣管哮喘患兒血清中IL-22與總IgE水平呈正相關(guān)

3 討論

兒童支氣管哮喘是一種由于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂導(dǎo)致的慢性氣道炎癥。兒童由于免疫系統(tǒng)發(fā)育受限，CD4+T細(xì)胞各亞群的表達(dá)也和成年人有所不同。既往認(rèn)為Th1細(xì)胞是支氣管哮喘的保護(hù)因素，在眾多哮喘病理機(jī)制中Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)導(dǎo)致的Th2細(xì)胞占主要地位被認(rèn)為是最為經(jīng)典的。但研究發(fā)現(xiàn)該失衡理論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有出入，阻斷Th2類細(xì)胞因子并不能有效的緩解哮喘，因此不能完全解釋支氣管哮喘的病理機(jī)制[5]。支氣管哮喘主要是由IgE作為媒介傳導(dǎo)的氣道過敏性反應(yīng)，IgE的水平變化與支氣管哮喘的誘發(fā)以及輕重程度有很大的關(guān)系。國外研究調(diào)查顯示，在支氣管哮喘的發(fā)病過程中，59%左右的哮喘為中性粒細(xì)胞型，而僅有41%的哮喘為嗜酸粒細(xì)胞型，兒童哮喘大多為中性粒細(xì)胞型[6]。

一直以來，IL-9一直被看做是Th2細(xì)胞分泌的相關(guān)因子，直至2008年Th9細(xì)胞以一種獨(dú)立新型CD4+T細(xì)胞的身份被發(fā)現(xiàn)。雖然Th2細(xì)胞也可以分泌IL-9但分泌量遠(yuǎn)不及Th9細(xì)胞多。人類Th9細(xì)胞與鼠類不同，主要表達(dá)IL-9，而并不表達(dá)IL-10[7]。IL-9對淋巴B細(xì)胞有直接作用，能夠共同與IL-4調(diào)控IgE合成；誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞增殖，從而釋放IL-8通過正反饋調(diào)節(jié)來招募更多中性粒細(xì)胞；促使肥大細(xì)胞增殖，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-9可增強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞對IL-5受體α鏈的表達(dá)能力，同時(shí)調(diào)節(jié)一些趨化因子Eotaxin等來促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞前體在肺部的的分化、成熟和聚集，參與哮喘發(fā)病[9]。本次研究結(jié)果顯示，哮喘發(fā)作組及哮喘緩解組外周血Th9及相關(guān)細(xì)胞因子IL-9的水平與健康對照組相比均顯著升高，支氣管哮喘患兒血清中IL-9與總IgE水平之間呈正相關(guān)，這與黃璇[10]等人的結(jié)果相一致。這提示了Th9及細(xì)胞因子IL-9與支氣管哮喘患兒疾病嚴(yán)重程度之間呈正相關(guān)，這可以作為哮喘活動期的一種重要標(biāo)志。國外學(xué)者通過評估阻斷IL-9對慢性氣道炎癥的影響發(fā)現(xiàn)，抗IL-9抗體可以減少由于慢性氣道炎癥和氣道重塑導(dǎo)致的細(xì)胞浸潤[11]。抗IL-9抗體可以減少Th17細(xì)胞、Th9細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞的數(shù)量并抑制細(xì)胞因子的合成和分泌，減少IgE在淋巴B細(xì)胞中的合成，這為今后兒童支氣管哮喘的醫(yī)治提供了新途徑。

不同于Th17、Th9等細(xì)胞Th22細(xì)胞是一種以分泌IL-22為主的的新型CD4+T細(xì)胞。不同的炎癥介質(zhì)和Th22細(xì)胞的配體依賴轉(zhuǎn)錄因子AHR能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群對IL-22的表達(dá)。TNF-α，IL-6和活性維生素D都被認(rèn)為能夠增強(qiáng)Th22細(xì)胞對IL-22的表達(dá)[12]。在氣道嗜酸性炎癥中，IL-22可以與TNF-α一同誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-25，改變樹突狀細(xì)胞的功能并來抑制氣道過敏性炎癥反應(yīng)[13]。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)[14]，不同研究者對于IL-22在哮喘中的作用持有“促炎”和“抑炎”兩種不同的觀點(diǎn)：有學(xué)者在小鼠的哮喘模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OVA致敏、激發(fā)后，IL-22敲除后小鼠與野生型相比氣道過敏性反應(yīng)明顯增強(qiáng)、氣道的反應(yīng)性增高；但也有學(xué)者經(jīng)研究后認(rèn)為，在慢性中重度哮喘患兒外周血中IL-22 mRNA表達(dá)明顯升高，與此同時(shí)其含量與血清總IgE水平之間呈正相關(guān)。張旃[15]等通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-22在哮喘中究竟發(fā)揮的“促炎”還是“抑炎”作用取決于其表達(dá)的階段和組織微環(huán)境：在氣道平滑肌細(xì)胞的分化成熟過程中濃度的高低具有決定性的意義，細(xì)胞在高濃度的IL-22存在下增殖能夠被顯著抑制，而在低濃度的時(shí)候則恰恰相反；對于氣道成纖維細(xì)胞來說，在哮喘后續(xù)階段，IL-22的效果微乎其微。對于人氣道的上皮細(xì)胞，IL-22有雙重影響：在哮喘發(fā)生的啟動階段，氣道上皮細(xì)胞在IL-22的作用下能夠加速壞死進(jìn)程，從而達(dá)到抑制分化增殖、促進(jìn)氣道炎癥的目的；但在后續(xù)階段IL-22則可能具有保護(hù)組織的作用[16]。本研究顯示，與哮喘緩解組、健康對照組相比，哮喘發(fā)作患兒體內(nèi)Th22及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-22的分泌明顯升高，血清中IL-22與總IgE水平之間呈正相關(guān)，這和施靈敏[17]等人的研究結(jié)果相符。提示Th22及相關(guān)細(xì)胞因子IL-22參與了哮喘的發(fā)病過程并與哮喘患兒疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

綜上所述，支氣管哮喘患兒外周血中Th9和Th22及其相關(guān)細(xì)胞因子是小兒支氣管哮喘的發(fā)病過程中的重要角色，為高級免疫干預(yù)治療提供了新可能性。臨床上可以通過檢測哮喘患兒體內(nèi)細(xì)胞因子水平變化并結(jié)合哮喘患兒的臨床表現(xiàn)來進(jìn)行病情的評估，進(jìn)而可以探討能否使用細(xì)胞因子相關(guān)的拮抗劑或者調(diào)控劑來輔佐治療兒童哮喘，為哮喘患兒的初期診斷和初期治療提供科學(xué)的手段。