劉 芬,呂文偉,陳 霞

(吉林大學基礎醫(yī)學院,吉林 長春130021)

氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait.)等中提取的生物堿，具有四環(huán)的喹嗪啶類結構。本課題組前期實驗研究證明，氧化苦參堿(OMT)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等多種藥理作用[1-3]。另據(jù)研究報道，氧化苦參堿體內半衰期較短，生物利用度低[4]。有學者認為是由于氧化苦參堿水溶性較強，難于通過生物膜的原因[5]。因此，氧化苦參堿的制劑已嚴重限制了其臨床應用。為提高生物利用度，延緩藥物在人體內釋放的速率、降低人體對藥物成分吸收速率的作用。本實驗用氧化苦參堿與氧化苦參堿緩釋片比較抗血栓、改善血液流變性指標的作用，觀察氧化苦參堿緩釋制的作用效果。

1 材料與方法

1.1 動物

Wister大鼠，雌雄各半，體重230-250 g，由長春市億斯實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK-吉2015-0001。

1.2 藥品

氧化苦參堿(質量分數(shù)>99%)，由寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司生產；0.9%生理鹽水，批號：150624D9，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司生產；鹽酸腎上腺素注射液，批號：4A09006，上海禾豐制藥有限公司生產；水合氯醛，批號：20010712，上?；瘜W試劑公司生產；二磷酸腺苷(ADP )，批號：990220，上?；瘜W試劑公司生產；枸櫞酸鈉，批號：20100727，北京化工廠；磷酸緩沖液粉劑，批號：AR0030，博士德生物有限公司；肝素，批號：421F024；上海化學試劑廠。緩釋片制備方法：氧化苦參堿40.0 g、羥丙甲纖維素30.0 g、丙烯酸樹脂10.0 g、加入適量的90%乙醇水溶液，制軟材50-60℃干燥，加人1%硬脂酸鎂和3%乳糖混勻，壓制100片即得氧化苦參堿緩釋片。

1.3 儀器

半自動血液流變儀，型號，北京普利生生產，血液混勻儀，型號，HY-1，北京宏潤達科技發(fā)展有限公司，小動物血栓形成儀，型號，YLS-14B，濟南益延科技發(fā)展公司，全自動血小板凝聚儀，型號，LBY-NJ2，北京普利生生產，自動平衡離心機，型號，LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機生產。半自動凝血分析儀，型號，PUN-2048A,北京普朗新技術有限公司。

1.4 方法

1.4.1實驗分組及給藥

實驗分為6組，每組20只。分組及給藥劑量如下：模型組、正常對照組給予生理鹽水，OMT對照組劑量為200.0 mg·kg-1，OMT緩釋片劑量為50.0、100.0、200.0 mg·kg-1。按上述劑量灌胃給藥，每日一次，連續(xù)給藥7天。

1.4.2制備急性血瘀模型

除正常對照組外，其它5組動物末次灌胃給藥1 h后每只大鼠sc注射2次0.1%鹽酸腎上腺素，每次0.8 ml·kg-1，間隔4 h，中間進行一次冰水浴，溫度保持0-2℃，浸泡5 min，大鼠禁食不禁水12 h。

1.4.3OMT緩釋片對血瘀大鼠全血黏度、血漿黏度的測定

每組取10只大鼠，皮下注射10%水合氯醛3 ml·kg-1進行麻醉，在腹部正中剪開皮膚，于腹主動脈插管取血，1%肝素抗凝(血液與抗凝劑的體積比為9∶1),應用LBY-N6K半自動血液流變儀測定全血高切比黏度、低切比黏度及血漿黏度。

1.4.4OMT緩釋片對血瘀大鼠體內、體外血栓的測定

每組取10只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射3 ml·kg-1進行麻醉，頸部常規(guī)手術，分離右側頸總動脈約15 mm，避免損傷血管表面和周圍神經(jīng)影響結果，將剝離好的頸總動脈勾入紅外線監(jiān)測探頭的溝槽內，記錄因動脈官腔內血栓形成阻塞率達20%左右的時間，即血栓形成時間。實驗結束后，腹主動脈取血1.8 ml注入內徑4 mm硅膠管內，置入37℃血液混勻儀內，轉動15 min，取出血栓，測量體外血栓長度。濾紙吸凈血栓水分，稱血栓濕量。將血栓放入干燥箱，60℃烘烤15 min，稱重,即為血栓干重。

1.4.5OMT緩釋片對血瘀模型大鼠血小板聚集率及PT、APTT的測定

從上述血瘀模型大鼠腹主動脈取動脈血3 ml，用3.28%枸櫞酸鈉抗凝(血液與抗凝劑的體積比為9∶1)，以1 500 rpm離心5 min，制備富血小板血漿(PRP)，其余血液3 000 rpm離心10 min，獲取貧血小板血漿(PPP)，以PPP調零，在200 μl PRP中加入ADP， ADP誘導劑最終濃度為4 μM/L，應用LBY-NJ2全自動血小板凝聚儀測定血小板5 min內最大聚集率。取貧血小板血漿(PPP)，采用PUN-2048A型血小板凝血分析儀測定凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶原時間(APTT)。

1.4.6統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x—±s)表示，均數(shù)比較用單因素方差分析(One-wauANDVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氧化苦參堿緩釋片對全血和血漿黏度的影響

高切比黏度、低切比黏度、血漿黏度指標與正常對照組比較，模型組差異有顯著性(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，OMT200 mg·kg-1、OMT緩釋片50.0、100.0、200.0 mg·kg-1可降低高切比黏度和低切比黏度。血漿黏度則表現(xiàn)在OMT緩釋片100.0、200.0 mg·kg-1組，見表1。

表1 氧化苦參堿緩釋片對全血和血漿黏度的影響(x—±s，n=10)

注：與正常對照組比較#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.2 氧化苦參堿緩釋片對體內、體外血栓的影響

OMT200 mg·kg-1、OMT緩釋片100.0、200.0 mg·kg-1可明顯降低血栓長度、濕重、干重質量(P<0.05，P<0.01)，模型組與正常對照組比較血栓形成時間差異有顯著性(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，說明模型成立。OMT200 mg·kg-1、OMT緩釋片100.0、200.0 mg·kg-1組可明顯延緩電刺激大鼠頸總動脈血栓的形成，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.001)。見表2。

表2 氧化苦參堿緩釋片對體外血栓、體內血栓形成時間的影響(x—±s，n=10)

注：與正常對照組比較 #P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.3 氧化苦參堿緩釋片對血小板聚集率、PT、APTT的影響

模型組與正常對照組比較血小板最大聚集率差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，OMT200 mg·kg-1、OMT緩釋片100.0、200.0 mg·kg-1組與模型組比較降低血小板聚集率(P<0.05，P<0.01)。OMT200 mg·kg-1、OMT緩釋片100.0、200.0 mg·kg-1組延長凝血酶原(PT)和活化部分凝血酶原(APTT)凝集時間。見表3。

表3 氧化苦參堿緩釋片對血小板聚集率、PT、APTT的影響(x—±s，n=10)

注：與正常對照組比較#<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本課題組已對氧化苦參堿對大鼠局灶性腦缺血性損傷的保護作用進行了研究[6]。氧化苦參堿緩釋片具體藥理作用，尚未見報道。本研究觀察氧化苦參堿緩釋片抗血栓作用。以血栓和血液流變學相關指標為觀察點，結果表明氧化苦參堿緩釋片能夠劑量依賴性改善皮下注射腎上腺素加冰水冷浴法所致的大鼠急性血瘀模型作用，延長凝血時間、體外血栓形成時間、降低血瘀大鼠血粘度、血小板聚集率、降低大鼠血栓干、濕重質量。目前許多研究表明，血管內皮細胞的損傷和血流狀態(tài)的變化是血栓形成的重要原因[7]。由于紅細胞處于聚集狀態(tài)，在毛細血管中流動則顯示全血低切黏度狀態(tài)，如果紅細胞處于分散狀態(tài)，在大血管中流動則顯示全血高切黏度狀態(tài)。在體外血栓實驗中，由于加熱可使蛋白變形，血液凝固性增加，導致血栓形成[8]。本實驗結果顯示，與模型組比較，氧化苦參堿緩釋片能夠改善血液流變學相關指標，降低血栓形成。特別是氧化苦參堿緩釋片100.0 mg·kg-1劑量組，在各個指標中作用均與氧化苦參堿200.0 mg·kg-1劑量組相同，提示氧化苦參堿緩釋片具有用量小的特點，可有效的應用在臨床抗血栓治療。