消化道腫瘤是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤。中國人群消化道腫瘤的發(fā)病率逐年升高，其中胃癌發(fā)病率位居第3位，結(jié)直腸癌位居第5位［1］。絕大多數(shù)胃癌為散發(fā)性病例，但約10%患者具有家族聚集特征，其中約1/3被認為具有遺傳背景。遺傳性彌漫型胃癌主要與CDH1的胚系突變有關，病理類型多為彌漫型和（或）印戒細胞癌；除了胃癌，小葉性乳腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生率也明顯升高［2］。對于遺傳家系中CDH1基因突變攜帶者終生胃癌發(fā)病風險高達60%～80%［3］。同樣在結(jié)直腸癌中，約30%患者具有家族遺傳特征，其中有明確致病因素的遺傳性結(jié)直腸癌約占5%～6%［4］。目前，發(fā)病率最高、研究相對系統(tǒng)的Lynch綜合征約占全部結(jié)直腸癌的3%，由錯配修復基因的胚系突變導致，其攜帶者具有早發(fā)結(jié)直腸癌和易患第二原發(fā)腫瘤的特點［5-7］。對于攜帶腫瘤遺傳相關基因人群進行及時的診斷和規(guī)范的隨訪監(jiān)測，有助于降低該特定人群腫瘤發(fā)生率及死亡率，具有明確的一、二級預防價值。

對遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary non?polyposis colorectal cancer，HNPCC）來說，雖然修正的“百慕大標準”明顯提高了診斷的敏感度，但仍有20%～30%患者會被遺漏［7］。遺傳性彌漫性胃癌更因國內(nèi)認知及研究匱乏，容易被臨床忽視。目前，關于遺傳性消化腫瘤篩查的結(jié)果顯示，50%甚至更多符合臨床診斷的患者或家系無法找到明確的分子致病機制。其原因包括：1）目標基因新的致病性突變未被發(fā)現(xiàn)；2）由于臨床表現(xiàn)多樣和腫瘤家族史不典型，其臨床診斷的遺傳綜合征與遺傳致病基因不符。因此，傳統(tǒng)的表型特異性單基因檢測模式已難以滿足當前遺傳性消化道腫瘤的診療需求。隨著測序技術的進步［8］，對遺傳性腫瘤多基因平臺的同時性檢測，極大地推動了低外顯率及未知突變的發(fā)現(xiàn)，因此運用二代測序的方法對遺傳性消化道腫瘤進行篩查具有廣闊的臨床應用前景。

本文擬通過發(fā)病年齡、家族史、病理類型、腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)等遺傳性消化道腫瘤的危險因素，篩選高危人群，通過二代測序的方法同時性檢測42個遺傳性腫瘤相關基因，探索對遺傳性消化道腫瘤高危患者進行遺傳篩查的意義及不同危險因素在患者篩選中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2016年3月至2016年4月收治于北京大學腫瘤醫(yī)院的322例結(jié)直腸癌及胃癌患者，篩選滿足遺傳性胃腸腫瘤的高危人群，入組患者需滿足下述1項：1）患者年齡≤30歲，不論有無家族史；2）患者年齡≤35歲，不論有無家族史；特殊病理類型：印戒細胞癌或黏液腺癌；3）患者年齡≤50歲；且≥1位一級親屬中發(fā)生惡性腫瘤；4）≥2位一、二級親屬發(fā)生惡性腫瘤，其中至少1位是一級親屬；5）患者本身≥2種惡性腫瘤，且患第1種惡性腫瘤時年齡≤50歲；6）組織標本微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）或錯配修復蛋白缺失。共篩選79例滿足入組條件患者，排除臨床資料不完善及樣本不完整者，共入組患者25例。本研究經(jīng)過北京大學腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批（編號：2016YJZ52）。

1.2 方法

1.2.1 標本的獲取 入組患者抽取外周血5 mL，使用 Maxwell?RSC DNA FFPE Kit試劑和 Maxwell?RSC自動提取儀（均購自美國Promega公司）按照說明書標準操作流程進行全血樣本DNA提取。提取的DNA使用NanoDropTM2000（購自美國Thermo Fisher公司）進行檢測，使用Qubit?3.0熒光定量儀（購自美國Thermo Fisher公司）進行定量。

1.2.2 胚系基因檢測 所有患者均進行了42個遺傳性腫瘤相關基因的胚系檢測，包括：APC、ATM、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、CDH1、CDKN2A、CFTR、CHEK2、CTNNA1、DDB2、EPCAM、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FANCC、FANCG、GALNT12、GREM1、MLH1、MLH3、MSH2、MSH6、MSR1、MUTYH、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、POLH、PRSS1、PTEN、SMAD4、SPINK1、STK11、TGFBR2、TP53、XPA、XPC。

1.2.3 技術及數(shù)據(jù)分析 全外顯子組高通量測序技術基于美國Agilent公司的SureSelect全外顯子組捕獲技術對人類全部已知基因的外顯子區(qū)域進行捕獲。采用SureSelect Human All Exon V5+UTRs Kit試劑盒。捕獲后的DNA序列采用美國Illumina公司的HiSeq X10高通量測序平臺的標準文庫構(gòu)建和測序流程進行測序測序，對高通量數(shù)據(jù)運用GATK（Genome Analysis Toolkit，https：//software.broadinstitute.org/gatk/）標準方法流程進行分析，基因突變位點的臨床意義主要參照ClinVar數(shù)據(jù)庫［9］。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究共入組25例患者，其中男性占48%（12/25），≤50歲的患者占72%（18/25），結(jié)直腸癌和胃癌患者分別占76%（19/25）和24%（6/25），腫瘤組織有黏液腺癌和印戒細胞癌成分的占42%（10/25），絕大多數(shù)患者具有腫瘤家族史80%（20/25），2例患者自身患有2種惡性腫瘤，免疫組織化學顯示錯配修復基因表達缺失（mismatch repair-deficient，dMMR）的患者占32%（8/25），錯配修復蛋白表達正常（mismatch repair-proficient，pMMR）的患者占28%（7/25），微衛(wèi)星狀態(tài)未知的患者占40%（10/25）。

2.2 突變患者臨床分子特征

入組的25例患者中，6例患者檢測到病理性胚系突變，總發(fā)生率為24%。其中50%（3/6）患者腫瘤組織表現(xiàn)為錯配修復蛋白缺失，83%（5/6）患者發(fā)病年齡≤50歲且具有惡性腫瘤家族史（表1）。

1例MYH相關性息肉病患者［10（MUTYH，c.467G＞A：p.Trp156Ter）臨床診斷為胃腸息肉綜合征及早發(fā)結(jié)腸癌，該患者2例一級親屬均在35歲診斷為結(jié)直腸癌，1例一級親屬因結(jié)腸息肉行全結(jié)腸切除術。1例APC（c.3126_3130del：p.I1042fs）移碼突變患者臨床表現(xiàn)出家族性腺瘤性息肉病的特征，并且其2例一級親屬及1例二級親屬均于50歲前診斷出結(jié)直腸癌。4例患者攜帶遺傳性結(jié)直腸癌相關基因突變，其中1例MLH1（c.2041G＞A：p.Ala681Thr）錯義突變?yōu)長ynch綜合征明確的致病突變［11］；1例MLH3（c.2221G＞T：p.Val741Phe）胚系突變的患者40歲診斷為直腸腺癌，該患者的哥哥存在MLH3相同位點的突變，并且臨床表現(xiàn)為小腸腺鱗癌及肝癌，進一步提供家系驗證；1例TGFBR2突變（c.C944T：p.T315M）患者41歲診斷為升結(jié)腸中分化腺癌伴黏液腺癌，并且其降結(jié)腸及小腸均發(fā)現(xiàn)腺癌病灶；1例患者檢測出MSH6（c.C1387T：p.Q463X）的胚系無義突變，且該患者腫瘤組織MSH6蛋白表達缺失。

全部入組患者滿足的篩選條件及致病突變患者在其中所占的比例，見表2。全部患者中滿足年齡≤50歲且≥1例一級親屬發(fā)生惡性腫瘤的比例最高（52%），滿足≥2例一級/二級親屬發(fā)生惡性腫瘤，其中至少1例是一級親屬的患者11例（44%），錯配修復蛋白缺失的患者占32%（8/25）。

表1 具有致病性突變患者的臨床特征及突變基因

表2 滿足不同入組標準的全部患者人數(shù)及致病突變患者的比例

3 討論

遺傳性胃腸道腫瘤綜合征是一組非表型特異性的疾病，以家系中個體腫瘤遺傳易感為特征［12］。近年來，隨著對腫瘤遺傳綜合征認知的進步和基因檢測技術的進步，遺傳性腫瘤的臨床診斷和致病機理研究也得到了發(fā)展。如遺傳性結(jié)直腸癌分類的細化及新的致病基因和突變位點的發(fā)現(xiàn)［6，13-15］，以及遺傳性慢性胃癌與CDH1基因突變的關系及臨床診斷標準的改進等。中國對于遺傳性胃腸道腫瘤的研究雖然起步較晚，但是相關研究也提示國內(nèi)外遺傳性腫瘤發(fā)生譜不同的可能［16］。最近，Pearlman 等［17］針對450例早發(fā)結(jié)直腸患者應用二代測序進行25個遺傳相關基因的篩查，結(jié)果顯示72例患者具有遺傳相關基因的胚系致病突變。接近16%的高突變率提示二代測序在遺傳性腫瘤綜合征研究中的應用價值。

由于遺傳性腫瘤綜合征的臨床表現(xiàn)多樣和腫瘤家族史不典型，其臨床診斷與遺傳致病基因不符的情況較為常見，傳統(tǒng)的表型特異性單基因檢測模式已不適用于當前遺傳性消化道腫瘤的診療需求。本研究結(jié)合目前研究相對成熟的遺傳性彌漫性胃癌及Lynch綜合征［11］的臨床診斷標準，以發(fā)病年齡、特殊病理類型、惡性腫瘤家族史等因素作為高危人群的篩選條件，運用二代測序技術檢測42個腫瘤遺傳相關基因的全外顯子，發(fā)現(xiàn)24%患者攜帶致病性胚系突變。其中3例分別為具有明確致病性MLH1、APC和MUTYH胚系突變，并且這些突變與患者的臨床病理學特征相符。另外，1例攜帶MLH3 c.2221G＞T突變患者40歲診斷為直腸腺癌且具有Lynch綜合征相關惡性腫瘤家族史，雖然該基因突變位點在ClinVar數(shù)據(jù)庫中顯示致病性有爭議，但患者的一級親屬（哥哥）臨床診斷小腸腺鱗癌及肝臟神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，同時檢測出MLH3相同位點的突變，提供了家系驗證。并且既往研究也報道了2例攜帶MLH3 c.2221G＞T突變的Lynch相關腫瘤家系［18-19］，第一個家系中先證者為1例71歲診斷結(jié)直腸癌的男性患者，2例一級親屬分別于57歲和61歲診斷為乳腺癌及胃癌，3例患者均存在MLH3 c.2221G＞T突變。第二個家系先證者為1例子宮內(nèi)膜癌女性患者，本身及2例一級親屬均存在MLH3 c.2221G＞T突變，且其中1例一級親屬也診斷為子宮內(nèi)膜癌。1例患者檢測出TGFBR2胚系突變（c.C944T：p.T315M），既往報道該突變位點存在于微衛(wèi)星穩(wěn)定的HNPCC家系中［20］。1例腫瘤組織MSH6蛋白表達缺失的患者，檢測出MSH6的無義突變。本研究結(jié)果顯示，即使通過比較寬松的條件篩選遺傳性消化道腫瘤的高?；颊撸渲胁±硇酝蛔兊陌l(fā)生率仍可達25%，較以往整體人群5%的比例明顯提高。胚系突變檢出率的提高將有助于對攜帶者進行早期的診斷和調(diào)整相應的隨訪監(jiān)測，從而最終降低該特定人群腫瘤發(fā)生率及死亡率，具有重要的一、二級預防價值。

遺傳性綜合征常具有多種腫瘤易感傾向，如本研究中攜帶MLH1致病突變的患者診斷為胃竇腺癌，臨床特征并不符合“阿姆斯特丹標準”；既往報道乳腺癌的家系符合遺傳性彌漫型胃癌的基因突變特點，使得針對單一腫瘤部位的遺傳篩查可能造成偏差及漏診［21］。因此，對遺傳性腫瘤高危人群篩選時可考慮不再對腫瘤原發(fā)部位進行嚴格限定。關于不同的篩選條件在遺傳性消化道腫瘤中的價值，研究初步顯示多原發(fā)腫瘤病史、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)及惡性腫瘤家族史在篩查遺傳性消化道腫瘤中的權重較大。攜帶致病突變的患者中，50%患者具有惡性腫瘤家族史，50%患者腫瘤組織錯配修復蛋白表達缺失。本研究顯示，患者的家族史及腫瘤組織微衛(wèi)星狀態(tài)在遺傳性腫瘤綜合征臨床診斷中具有重要作用。雖然進行更嚴格的年齡限定似乎并未增加遺傳性腫瘤的檢出率，但是攜帶致病性胚系突變的患者發(fā)病年齡均≤50歲，仍符合遺傳性腫瘤綜合征早發(fā)的特點。同樣，進行更嚴格的年齡限定似乎不如綜合患者的年齡、家族史和微衛(wèi)星狀態(tài)更具有臨床價值。

傳統(tǒng)的表型特異性單基因檢測模式不再適用于遺傳性腫瘤綜合征的診斷，近些年二代測序技術在遺傳病中應用的重要性也逐漸突出，尤其是全外顯子測序或針對多個遺傳相關基因譜的測序為遺傳性消化道腫瘤的診斷和研究提供了大量信息。對于具有遺傳性腫瘤家系進行二代測序，能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)檢測方法未發(fā)現(xiàn)和（或）既往尚未報道的新致病性基因突變［13，22］。同時，在具有消化道腫瘤遺傳性高危家系中，利用二代測序?qū)Χ鄠€相關遺傳基因檢測，可發(fā)現(xiàn)部分高危家系存在目前臨床標準無法診斷致病性的遺傳基因突變［23-24］。多基因平臺的同時性檢測，可以降低漏診率，一定程度上解決表型與基因型不一致的情況。如MLH3、TGFBR2與遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌的關系在本研究中得到了進一步驗證。

本研究具有樣本量小的局限性，并且檢測平臺均對目前已知的基因進行檢測，并不能發(fā)現(xiàn)新的致病基因。二代測序面臨的另外一個問題是檢測出大量意義未明的基因突變，目前尚缺乏統(tǒng)一的方法明確其意義。如何正確地解讀這些數(shù)據(jù)，需要多專業(yè)的交叉合作。綜上所述，通過高危因素的篩查，富集遺傳性消化道腫瘤的高危人群，進行多基因平臺的同時性檢測具有明確的臨床意義及良好的應用前景。

致謝：感謝領星生物科技有限公司提供技術支持，對本研究中的患者進行全外顯子組高通量測序及相關基因分析。