邱春華 張志宏 董丹丹 李良平

結直腸癌是中國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別位居第3位和第5位［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復基因（mismatch repair gene，MMR）的突變或甲基化，導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instabili?ty，MSI），是結直腸癌發(fā)生的重要機制之一［3］。占結直腸癌3%～5%的Lynch綜合征是由于MMR發(fā)生胚系突變所致的常染色體顯性遺傳性疾病。而在15%散發(fā)性結直腸癌中，錯配修復基因MLH1啟動子甲基化失活是其主要的發(fā)生機制，臨床特征與Lynch綜合征相似。2014年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡（NCCN）推薦初診結直腸癌患者應篩查Lynch綜合征［3］。

本研究采用免疫組織化學法檢測結直腸癌患者手術標本中MMR的表達情況，及其與臨床病理學的關系，并評價其在Lynch綜合征和散發(fā)性結直腸癌篩查中的價值，以期為臨床篩查Lynch綜合征提供簡便、快速、經(jīng)濟的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取四川省人民醫(yī)院2015年1月至2016年9月收治的結直腸癌患者607例，均經(jīng)術后病理確診，其中男性376例（61.94%），女性231例（38.06%）；年齡26～90歲，平均年齡63歲；排除術前接受過放化療的患者。采用免疫組織化學LDP法檢測切除的腫瘤組織標本中MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表達和P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40的表達情況，及與臨床病理的關系。本研究獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會的批準［倫審（研）2018年第149號］。

1.1.2 主要試劑 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 采用免疫組織化學LDP法。將患者手術切除的腫瘤標本，10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。按產(chǎn)品說明書操作，第一抗體分別為MLH1（鼠單抗，1:10）、MSH2（兔單抗，1:100）、MSH6（兔單抗，1:100）、PMS2（兔單抗，1:20）、P53（鼠單抗，1:100）、VEGF（兔多抗）、Ki-67（鼠單抗，1:100）、CD34（鼠單抗，1:100）、D2-40（鼠單抗，1:25），采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，MLH1、MSH2以正常結腸黏膜上皮表達情況作為陽性對照。MSH6、PMS2以結腸癌表達情況作為陽性對照。P53以乳腺癌表達情況作為陽性對照。VEGF以肝癌表達情況作為陽性對照。Ki-67、D2-40以扁桃體表達情況作為陽性對照。CD34以血管內(nèi)皮表達情況作為陽性對照。

1.2.2 結果判定 結合染色強度和陽性細胞百分比進行判斷［4］，由兩位病理科醫(yī)生獨立完成結果判定。

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、P53、Ki-67蛋白均位于細胞核，VEGF蛋白定位于細胞質(zhì)/細胞膜，CD34定位于血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)。D2-40蛋白定位于淋巴管細胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色染色為表達（+），不著色為缺失（-）。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白中任意一種不表達判定為MMR表達缺失，而MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白均表達則判定為MMR完整。

1.2.3 隨訪 每3個月隨訪1次，門診隨訪和電話隨訪相結合，根據(jù)患者的檢查結果、治療方案，觀察總體生存和無瘤生存情況。隨訪時間為20～40個月，截至2018年4月。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMR在結直腸癌中的表達

607例標本中，共 216例 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達缺失，MMR表達缺失率為35.58%。其中男性136例，女性80例，年齡≤50歲41例。將216例MMR蛋白表達缺失患者設為陰性組，391例表達正?；颊咴O為陽性組，兩組在腫瘤位置比較（左半結腸vs.右半結腸，直腸vs.右半結腸）差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1），MMR蛋白陰性組右半結腸癌高發(fā)，陽性組左半結腸癌和直腸癌高發(fā)。兩組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 MMR蛋白在結直腸癌中的表達

2.1.1 MMR一項表達缺失結果 MMR一項表達缺失，分別以MLH1、PMS2蛋白表達缺失為主。MLH1蛋白表達缺失率為3.95%，表達缺失組右半結腸8例，左半結腸+直腸16例；表達陽性組右半結腸60例，左半結腸+直腸331例。兩組在腫瘤位置的比較（左半結腸/直腸vs.右半結腸），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PMS2蛋白表達缺失率為11.04%，表達缺失組右半結腸17例，左半結腸+直腸50例；表達陽性組右半結腸60例，左半結腸+直腸331例。兩組在腫瘤位置的比較（左半結腸/直腸vs.右半結腸），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MLH1蛋白、PMS2蛋白陰性組右半結腸癌高發(fā)，陽性組左半結腸癌和直腸癌高發(fā)。

2.1.2 MMR多項表達缺失結果 MMR聯(lián)合兩項表達缺失，以MLH1/PMS2聯(lián)合表達缺失為主。MLH1/PMS2蛋白表達缺失率為14.50%，表達缺失組右半結腸49例，左半結腸+直腸39例；表達陽性組右半結腸60例，左半結腸+直腸331例。右半結腸癌MLH1/PMS2蛋白表達缺失率明顯高于左半結腸癌和直腸癌（P＜0.01）。MMR三項聯(lián)合表達缺失 6例，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6同時表達缺失4例。

2.2 MMR蛋白表達與臨床病理學關系

MMR蛋白表達缺失的陰性組，高/中分化146例，低分化70例；表達正常的陽性組，高/中分化313例，低分化78例。兩組在腫瘤分化程度（高/中分化vs.低分化）的比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表2）。MMR蛋白表達缺失的陰性組，Ⅰ/Ⅱ期87例，Ⅲ期129例；表達正常的陽性組，Ⅰ/Ⅱ期190例，Ⅲ期201例。兩組TNM分期（Ⅰ/Ⅱvs.Ⅲ）比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。MMR蛋白表達缺失的陰性組，有淋巴結轉移67例，無淋巴結轉移149例；表達正常的陽性組，有淋巴結轉移199例，無淋巴結轉移192例。兩組淋巴結轉移比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表2）。兩組腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組腫瘤病理類型的比較顯示，與黏液/印戒分化無關，與淋巴細胞浸潤無關，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 MMR蛋白在結直腸癌中的表達與病理學關系

2.3 P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40在結直腸癌中的表達

MMR蛋白表達缺失的陰性組，VEGF陽性152例，陰性64例；表達正常的陽性組，VEGF陽性334例，陰性57例，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表3）。MMR蛋白表達缺失的陰性組，Ki-67在1%～50%有97例，51%～100%有119例；表達正常的陽性組，Ki-67在1%～50%有132例，51%～100%有259例，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表3）。左半結腸癌和直腸癌的VEGF、Ki-67表達水平高于右半結腸癌。MMR蛋白表達缺失的陰性組和表達正常的陽性組P53、CD34、D2-40的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 VEGF、Ki-67在結直腸癌中的表達

3 討論

2017年中國癌癥數(shù)據(jù)報告顯示結直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，分別位居男性腫瘤發(fā)病率的第4位，女性的第3位，城市年發(fā)病率高達33.17/10萬人［1-2，5］。有研究發(fā)現(xiàn)，MMR突變或甲基化導致的MSI，是結直腸癌發(fā)生的重要機制之一［3］。本研究在MMR蛋白表達缺失中分別以MLH1、PMS2、MLH1/PMS2蛋白表達缺失為主，提示MMR蛋白表達陰性組右半結腸癌高發(fā)，陽性組左半結腸癌和直腸癌高發(fā)。右半結腸癌和左半結腸癌在胚胎來源、分子特征、致癌機制等方面存在差異。右半結腸癌與MMR缺失、MSI陽性表達、MLH1基因甲基化、BRAF基因突變等相關，左半結腸癌與抑癌基因APC、P53等的失活、KRAS基因突變相關［6］。

發(fā)病部位為MLH1/PMS2蛋白表達的獨立影響因素。若MLH1/PMS2蛋白缺失，可進一步安排BRAF V600E突變和MLH1啟動子區(qū)甲基化的檢測，如結果為陰性應進行MLH1/PMS2基因種系突變檢測，根據(jù)結果確定是否為Lynch綜合征［7-8］。本研究兩組患者在腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義。術后定期隨訪發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達缺失的陰性組，復發(fā)轉移8例，死亡2例；MMR蛋白表達正常的陽性組，復發(fā)轉移21例，死亡7例。有研究提示發(fā)病部位、TNM分期是MMR蛋白表達的獨立影響因素［9］。MMR蛋白表達缺失的結直腸癌有其獨特的生物學行為特征，中國多項研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤多位于右半結腸，腸外惡性腫瘤發(fā)病率較高，低分化腺癌常見，腫瘤預后好于散發(fā)性大腸癌［7，10］。家族史、低齡、右半結腸腫瘤、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤侵入固有肌層為中國可疑Lynch綜合征患者的高危臨床病理學因素［11］。

本研究兩組患者VEGF、Ki-67的比較，差異具有統(tǒng)計學意義，遠端結腸和直腸癌的VEGF表達水平高于近端結腸癌。腫瘤原發(fā)部位基因表達和突變的差異，影響化療和分子靶向藥物的效果，導致左、右半結腸癌患者的預后不同［12］?？寡苌梢种苿┴惙ブ閱慰拱邢蛑委煹寞熜Ш筒课淮嬖诿黠@關系，根據(jù)原發(fā)瘤部位選擇結直腸癌靶向治療，對現(xiàn)有治療方案選擇產(chǎn)生深遠影響［5］。Bendardaf等［13］研究顯示，在CAPEOX+貝伐珠單抗治療的患者中，與盲腸和升結腸癌比較，乙狀結腸和直腸癌的中位無進展生存時間和生存時間顯著延長。有研究發(fā)現(xiàn)，P53參與腺瘤-癌變途徑，可能僅對左半結腸癌有預后價值［14］。

Lynch綜合征占結直腸癌的3%～5%，是MMR發(fā)生胚系突變所致的常染色體顯性遺傳性疾病，具有患癌風險明顯增加、加速的癌變進程、發(fā)病年輕化等特點，需要與散發(fā)性結直腸癌鑒別［10］。對結直腸癌患者手術標本進行MMR的檢測，可以篩查Lynch綜合征患者和家族成員，避免漏診。近期國內(nèi)外指南和共識推薦結直腸癌患者進行MMR免疫組織化學或MSI的檢測，篩查Lynch綜合征［3，7］。MMR的檢測對外科決策較為重要，對于年輕的Lynch綜合征相關結直腸癌患者，推薦擴大結腸切除范圍［15］。在15%散發(fā)性結直腸癌中，MLH1啟動子甲基化失活是其主要的發(fā)生機制，臨床特征與Lynch綜合征相似，腫瘤多位于右半結腸，病理分期以Dukes B期為主，病理形態(tài)以隆起型多見，MLH1表達缺失率高于MSH2等，需要與Lynch綜合征鑒別［3，7］。

MMR在Ⅱ/Ⅲ期結直腸癌患者中可作為預后較好的生物學標志物［16］。某一MMR基因突變所導致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定增高（MSI-H），預示對氟尿嘧啶化療缺乏敏感性，不能從中受益［17］。結直腸癌的免疫治療中，dMMR/MSI-H是預測抗PD-1單抗療效的標志物。2017版NCCN指南中首次將免疫檢查點抑制劑PD-1單抗pembroli?zumab和nivolumab推薦用于具有dMMR/MSI-H分子表型的結直腸癌的末線治療［18］。MMR基因突變檢測為Lynch綜合征診斷的“金標準”，但因費用較貴限制了其臨床應用?；颊叩氖中g標本先進行MMR免疫組織化學法檢測，根據(jù)結果再確定是否進行基因種系突變的檢測［19］。一項回顧性研究顯示，免疫組織化學聯(lián)合檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失的敏感度為77%～100%，特異性為98%～100%，與MSI檢測相當［20］。另一項系統(tǒng)回顧研究表明，在結直腸癌患者中篩查Lynch綜合征，MSI檢測的敏感度為66.7%～100.0%，特異性為61.1%～92.5%。免疫組織化學法檢測的敏感度為80.8%～100.0%，特異性為80.5%～91.9%。兩種檢測方法均可較好地用于Lynch綜合征的篩查［19］。因此，免疫組織化學法檢測可作為MMR缺失分析的首選篩選方法，達到初步篩選Lynch綜合征患者的目的［20］。

綜上所述，MMR蛋白檢測的應用，為結直腸癌患者及時篩查發(fā)現(xiàn)、治療及隨訪Lynch綜合征相關惡性腫瘤提供了簡便有效的方法，由此可降低患癌的風險，不斷提高人類健康水平。