閆義濤 王曉麗 谷圓圓 任艷凡 胡俊喜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科,新鄉(xiāng)453003 )

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是兒童最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，占所有兒童期惡性腫瘤的3%[1]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤通常會出現(xiàn)白帶病及斜視。在該疾病的晚期，兒童可能會表現(xiàn)出突出癥、布眼癥或低視癥[2]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤會嚴(yán)重影響患者及家庭成員的心理健康，給社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[3,4]。因此，加深視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的研究迫在眉睫。長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一類長于200 bp的非編碼RNAs。LncRNAs會影響細(xì)胞內(nèi)平衡的各個方面，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。microRNA可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄效率，抑制目標(biāo)信使RNA翻譯的起始和延伸，促進(jìn)目標(biāo)信使RNA衰變，降低從目標(biāo)信使RNA合成的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等。許多l(xiāng)ncRNAs是通過與microRNA相互作用發(fā)揮作用[5-8]。細(xì)胞系SO-Rb50來源于一個53 d大沒有視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤家族史，患左眼視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的女孩。本研究的主要目的是探究lncRNA MALAT1對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50增殖、凋亡和侵襲的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系與主要試劑 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司。RNA提取試劑盒RNAiso Plus reagent和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自大連TaKaRa公司。熒光素酶檢測試劑盒來源于Promega公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SO-Rb50細(xì)胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。SO-Rb50細(xì)胞分為4組：sh-Ctrl(對照)組，sh-MALAT1組，miR-570 inhibitor組和sh-MALAT1+miR-570 inhibitor組。sh-MALAT1是一段特異性序列，可以干擾MALAT1表達(dá)。按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說明書將sh-MALAT1和miR-570 inhibitor分別或同時轉(zhuǎn)染SO-Rb50細(xì)胞，轉(zhuǎn)染shRNA scramble作為轉(zhuǎn)染對照。

1.2.2實(shí)時定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 用RNA提取試劑盒提取總RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，MALAT1上游引物：AAA GCAAGG TCT CCC CAC AAG，MALAT1下游引物：GGT CTG TGC TAG ATC。miR-570-3p上游引物：CGAAAACAGCAATTACCTTTGC，miR-570-3p下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCG。U6為內(nèi)參，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

1.2.3熒光素酶分析 首先移去細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液后加入PBS洗滌細(xì)胞，棄去洗滌液后在孔中加入1×的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。然后室溫振蕩5～10 min，3 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行發(fā)光測定。按照試劑盒說明書和儀器操作說明對待測樣品進(jìn)行發(fā)光值測定。

1.2.4腫瘤成球?qū)嶒?用胰酶將待測細(xì)胞消化后，1 500 r/min離心5 min。棄上清，加入PBS吹散洗滌細(xì)胞。反復(fù)洗滌3次后加入培養(yǎng)基制成1×102個/ml的單細(xì)胞懸液。然后將上述細(xì)胞懸液接種于6孔板中進(jìn)行腫瘤成球培養(yǎng)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù) 首先收集待測細(xì)胞，用1×的Binding buffer制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，最后流式細(xì)胞儀對染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.6Transwell檢測細(xì)胞侵襲 收集待測細(xì)胞后用添加1%胎牛血清的培養(yǎng)基將其制成細(xì)胞密度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后用0.5%的結(jié)晶紫對上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，同時用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對各實(shí)驗組數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ShRNA干擾lncRNA MALAT1表達(dá) 通過qRT-PCR分析lncRNA MALAT1表達(dá)檢測sh-MALAT1干擾效果。由圖1可知，sh-Ctrl組與SO-Rb50中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)無明顯差異。與SO-Rb50組相比，sh-MALAT1組lncRNA MALAT1表達(dá)明顯降低。上述結(jié)果說明，sh-MALAT1已成功將人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50的lncRNA MALAT1沉默。

2.2LncRNA MALAT1負(fù)向調(diào)控miR-570-3p表達(dá) 利用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染sh-MALAT1及miR-570 inhibitor后miR-570-3p表達(dá)。圖2顯示，轉(zhuǎn)染sh-MALAT1后miR-570-3p表達(dá)明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染miR-570 inhibitor后miR-570-3p表達(dá)明顯減弱。同時轉(zhuǎn)染sh-MALAT1和miR-570 inhibitor會抑制sh-MALAT1導(dǎo)致的miR-570-3p表達(dá)的升高。由此可見，在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50中，lncRNA MALAT1負(fù)向調(diào)控miR-570-3p表達(dá)。

2.3LncRNA MALAT1與miR-570-3p存在直接靶向關(guān)系 通過熒光素酶實(shí)驗進(jìn)一步驗證lncRNA MALAT1與miR-570-3p的靶向關(guān)系。如圖3所示，MALAT1野生型細(xì)胞與MALAT1突變體細(xì)胞熒光素酶活性無明顯差異。在MALAT1野生型細(xì)胞中添加miR-570 mimic后熒光素酶活性明顯降低。在MALAT1突變體細(xì)胞中添加miR-570 mimic則對熒光素酶活性無明顯影響。以上結(jié)果表明，LncRNA MALAT1與miR-570-3p存在直接靶向關(guān)系。

2.4Sh-MALAT1通過miR-570-3p降低SO-Rb50細(xì)胞增殖 利用腫瘤成球?qū)嶒灧治鰏h-MALAT1對SO-Rb50細(xì)胞增殖的影響。由圖4可知，sh-MALAT1組細(xì)胞數(shù)目明顯少于對照組。miR-570 inhibitor組細(xì)胞數(shù)目明顯多于對照組。

圖1 qRT-PCR檢測lncRNA MALAT1表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA MALAT1 was detected by qRT-PCRNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with So-Rb50 group and sh-Ctrl group,*.P<0.05.

圖2 qRT-PCR檢測miR-570-3p表達(dá)Fig.2 Expression of miR-570-3p was detected by qRT-PCRNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with added MALAT1 shRNA and miR-570 mock group, *.P<0.05；compared with added miR-570 mock group and MALAT1 shRNA and miR-570 inhibitor group, #.P<0.05.

與sh-MALAT1組相比，sh-MALAT1+ miR-570 inhibitor組細(xì)胞數(shù)目明顯升高。由此可見，sh-MALAT1可通過提高miR-570降低SO-Rb50細(xì)胞增殖。

2.5sh-MALAT1通過miR-570-3p誘導(dǎo)SO-Rb50細(xì)胞凋亡 為分析sh-MALAT1對SO-Rb50細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。圖5顯示，sh-MALAT1組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。MiR-570 inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組。sh-MALAT1+ miR-570 inhibitor組細(xì)胞凋亡率則明顯低于sh-MALAT1組。

圖3 熒光素酶分析lncRNA MALAT1與miR-570-3p的靶向關(guān)系Fig.3 Targeted relationship of lncRNA MALAT1 and miR-570-3p was verified by luciferase assayNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with MALAT1 wt, MALAT1 mut and miR-570 mimic groups，*.P<0.05.

圖4 腫瘤成球?qū)嶒灧治黾?xì)胞增殖Fig.4 Cell proliferation was analyzed by tumorsphere formation assayNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with miR-570 inhibitor group, *.P<0.05；compared with sh-Ctrl group and sh-MALAT1+inhibitor group, #.P<0.05.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig.5 Apoptosis was measured by flow cytometryNote: The Q4 quadrant is apoptotic cell,n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with sh-MALAT1 group,*.P<0. 05;compared with sh-Ctrl and sh-MALAT1+inhibitor groups,#.P<0. 05.

圖6 Transwell檢測細(xì)胞侵襲Fig.6 Cell invasion was detected by TranswellNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with miR-570 inhibitor group,*.P<0.05; compared with sh-Ctrl and sh-MALAT1+inhibitor group, #.P<0. 05.

上述結(jié)果表明，sh-MALAT1可通過提高miR-570增強(qiáng)SO-Rb50細(xì)胞凋亡。

2.6Sh-MALAT1通過miR-570-3p減弱SO-Rb50細(xì)胞侵襲 通過Transwell檢測細(xì)胞侵襲，分析sh-MALAT1對SO-Rb50細(xì)胞侵襲的影響。由圖6可知，sh-MALAT1組平均每個視野下侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯少于對照組。MiR-570 inhibitor組平均每個視野下侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯多于對照組。與sh-MALAT1組相比，sh-MALAT1+ miR-570 inhibitor組平均每個視野下侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多。以上結(jié)果說明，sh-MALAT1可通過提高miR-570減弱SO-Rb50細(xì)胞侵襲。

3 討論

目前對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療手段主要包括體外放射治療，全身化療，激光光凝術(shù)及眼動脈化學(xué)外科聯(lián)合玻璃體內(nèi)化療等，但這些治療方法都存在一些缺陷[8,9]。越來越多的研究表明lncRNAs在癌癥進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，具有成為癌癥靶向治療的潛能[10]。

大量文獻(xiàn)報道lncRNAs常常與microRNAs存在直接靶向關(guān)系。有數(shù)據(jù)顯示lncRNA H19可通過與miR-17-92相互作用調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)程[11]。有研發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Y79細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1可直接靶向miR-124[12]。此外，在腎臟透明細(xì)胞癌、腎癌及膀胱癌中，lncRNA MALAT1還可負(fù)向調(diào)控miR-200s、miR-205和miR-125b表達(dá)[13-15]。據(jù)報道在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)與miR-101和miR-217表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[16]。本研究表明，在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞SO-Rb50中，lncRNA MALAT1負(fù)向調(diào)控miR-570-3p表達(dá)，lncRNA MALAT1與miR-570-3p存在直接靶向關(guān)系。

細(xì)胞過度增殖是癌癥的常見特征。lncRNAs在調(diào)控細(xì)胞增殖方面具有重要作用。有研究顯示沉默視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Weri-Rb1細(xì)胞和Y79細(xì)胞的lncRNA BANCR會降低細(xì)胞增殖[17]。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)在膽囊癌細(xì)胞中干擾lncRNA MALAT1可通過miR-363-3p減弱細(xì)胞增殖。據(jù)報道在骨肉瘤細(xì)胞中沉默lncRNA MALAT1會通過miR-142-3p和miR-129-5p抑制細(xì)胞增殖[19]。有研究表明在絨毛膜癌細(xì)胞中，干擾lncRNA MALAT1表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖下降，但miR-218 inhibitor會抵消干擾lncRNA MALAT1對細(xì)胞增殖的抑制作用[20]。本文結(jié)果顯示，sh-MALAT1可抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-Rb50細(xì)胞增殖，miR-570 inhibitor會逆轉(zhuǎn)sh-MALAT1對細(xì)胞增殖的抑制。這說明，sh-MALAT1可通過提高miR-570降低SO-Rb50細(xì)胞增殖。

大量研究表明lncRNAs可調(diào)控癌細(xì)胞凋亡。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-Rb50細(xì)胞和Y79細(xì)胞中，干擾lncRNA CCAT1可通過負(fù)向調(diào)控miR-218-5p提高細(xì)胞凋亡。據(jù)報道在膀胱癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞中干擾lncRNA MALAT1可通過miR-125b、miR-195和miR-509提高細(xì)胞凋亡[22-24]。另外，沉默神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的lncRNA MALAT1后，細(xì)胞凋亡會增加，下調(diào)miR-101和miR-202表達(dá)會逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA MALAT1對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用[25,26]。本研究結(jié)果表明，sh-MALAT1可促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-Rb50細(xì)胞凋亡，miR-570 inhibitor會抵消sh-MALAT1對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)。由此可見，sh-MALAT1可通過提高miR-570增強(qiáng)SO-Rb50細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞侵襲在癌癥進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明lncRNAs會影響癌細(xì)胞侵襲能力。Dong等[27]發(fā)現(xiàn)干擾視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達(dá)可抑制細(xì)胞侵襲。據(jù)報道在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Y79細(xì)胞中沉默lncRNA MALAT1可通過靶向miR-124抑制細(xì)胞侵襲[28]。有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞、三陰乳腺癌細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞中干擾lncRNA MALAT1表達(dá)可抑制細(xì)胞侵襲，miR-204 inhibitor、miR-129 inhibitor和miR-206 inhibitor會逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA MALAT1對細(xì)胞侵襲的抑制作用[29-31]。在宮頸癌細(xì)胞中，siRNA干擾lncRNA MALAT1可通過靶向miR-214減弱細(xì)胞侵襲[32]。本文結(jié)果顯示，sh-MALAT1可抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-Rb50細(xì)胞侵襲，miR-570 inhibitor會減弱sh-MALAT1對細(xì)胞增殖的抑制。這說明，sh-MALAT1可通過提高miR-570降低SO-Rb50細(xì)胞侵襲。

本研究表明，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-Rb50細(xì)胞中，lncRNA MALAT1負(fù)向調(diào)控miR-570-3p表達(dá)，lncRNA MALAT1與miR-570-3p存在直接靶向關(guān)系。ShRNA干擾lncRNA MALAT1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖和侵襲，miR-570 inhibitor會減弱sh-MALAT1對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)和對細(xì)胞增殖和侵襲的抑制。綜上所述，shRNA干擾lncRNA MALAT1會通過miR-570-3p提高人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50凋亡，降低細(xì)胞增殖和侵襲。下一步計劃在體內(nèi)研究lncRNA MALAT1對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的影響。