車 楠 李 莉 李良昌 趙洪偉

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延吉133002)

哮喘是支氣管氣道的慢性炎癥性疾病，其特征在于慢性氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性，黏液過度分泌和氣道重構(gòu)。氣道平滑肌增生、氣道基底膜增厚、上皮下纖維化增殖、膠原沉積等均可導(dǎo)致氣道重構(gòu)，是哮喘預(yù)后不良的重要原因[1]。Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) 信號通路在哮喘中具有至關(guān)重要的作用，可以促進(jìn)氣道炎癥和高反應(yīng)性，上調(diào)T輔助細(xì)胞因子水平并增加黏液產(chǎn)生[2]。Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt可活化核因子κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)的抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB) 激酶加速IκB的降解,促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位,增強(qiáng)NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性。NF-κB活化后促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9 (Matrix metalloprotein 9,MMP-9)的基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步發(fā)揮促氣道重構(gòu)的作用[4]。樺褐孔菌多糖(Polysaccharide from Inonotus oblipuus，PIO)是藥用菌類樺褐孔菌(Inonotus oblipuus)的重要活性成分具有顯著的抗炎、抗癌、抗氧化以及抗糖尿病等[5]。研究表明，PIO具有抗哮喘作用[6]，但是其對于哮喘氣道重構(gòu)的作用以及機(jī)制尚無詳細(xì)研究。因此本研究利用OVA誘導(dǎo)建立哮喘小鼠氣道重構(gòu)模型，給予PIO治療，探討PIO對氣道重構(gòu)的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器 OVA(Sigma，美國)；IL-4、IL-5、IL-13和MMP-9 ELISA試劑盒(Invitrogen,美國)； Masson三色染色液(索來寶，中國)；anti-NF-κB p65(6956)，anti-MMP9(3852)，anti-PI3K(4255)，anti-p-PI3K(4228),anti-AKT(9272)，anti-p-Akt(9275)(Cell Signaling,美國)；β-actin，PARP(Santa Cruz，美國)；402型霧化器(四菱醫(yī)療器械廠，上海)；酶聯(lián)免疫檢測儀，電泳設(shè)備和Gel Doc凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；樺褐孔菌多糖由延邊大學(xué)藥學(xué)院提取。

1.2方法

1.2.1氣道重構(gòu)模型建立與分組 雌性BALB/c小鼠40只，體重(18±5)g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為對照組、模型組、樺褐孔菌多糖低劑量組(PIO-100)、樺褐孔菌多糖高劑量組(PIO-200)。除正常組外，其余各組小鼠于第1天和第7天腹腔注射溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的100 μg OVA 和氫氧化鋁混合液0.5 ml進(jìn)行致敏。第12天，OVA(1 mg/ml,溶于生理鹽水中)霧化吸入激發(fā)30 min,第19、20、33、34、47、48、61、62、75、76、89、90天以同樣的方法在同樣時間激發(fā),共13次。樺褐孔菌多糖組分別在激發(fā)前灌服PIO 100或200 mg/(kg·d)。

1.2.2實驗樣本獲取與處理 末次激發(fā)48 h后處死小鼠。收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)利用血球計數(shù)儀計細(xì)胞總數(shù)。4℃，3 000 r/min離心5 min，留取上清，于-80℃保存，待測細(xì)胞因子。細(xì)胞涂片后Diff-quik染色，鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)。取右肺下葉，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色觀察。其余各肺葉液氮速凍后-80℃保存待用。

1.2.3BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量的ELISA分析 按說明書操作，結(jié)果單位以pg/L表示。

1.2.4Western blot分析 參照文獻(xiàn)[7]方法。BCA方法測定蛋白濃度，上樣量20 μg總蛋白，10%SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳分離，然后250 mA、90 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉TBS-T緩沖液孵育1 h封閉，按1∶1 000加入相應(yīng)的稀釋抗體4℃過夜。第2天，洗膜后按1∶2 500孵育二抗1 h。加ECL發(fā)光試劑，利用Gel Doc進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1PIO減弱哮喘氣道重構(gòu)小鼠BALF中的細(xì)胞變化。如圖1所示，與對照組相比，模型組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著增加(P<0.05)；PIO干預(yù)后，能夠明顯降低OVA誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的增多。

2.2PIO能夠緩解哮喘氣道重構(gòu)小鼠的肺部病理變化。HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，模型組小鼠氣道重構(gòu)現(xiàn)象明顯：氣道黏膜水腫，上皮細(xì)胞增生，氣道壁內(nèi)平滑肌明顯增厚，氣道痙攣收縮，管腔狹窄，膠原過度沉積，氣道及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，PIO干預(yù)后的哮喘氣道重構(gòu)小鼠肺組織切片中炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，氣道結(jié)構(gòu)比較完整，平滑肌增厚以及膠原沉積現(xiàn)象明顯得到改善(圖2)。

2.3PIO能夠降低哮喘氣道重構(gòu)小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的升高。如圖3所示，ELISA結(jié)果顯示，模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯高于對照組(P<0.05)。而PIO能夠明顯降低哮喘氣道重構(gòu)小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平(P<0.05)。

圖1樺褐孔菌多糖對哮喘氣道重構(gòu)小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及組成的影響

Fig.1Effectofpolysaccharidefrominonotusoblipuusontotalanddifferentialcellularcomponentsofbronchoalveolarlavageinasthmaticmice

Note: A.Diff-quick staining of cells in BALF(×200,the arrows point to eosinophils);B.The changes of the inflammatory cells in BALF.#.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

圖2 樺褐孔菌多糖對小鼠肺部炎癥的影響(×200)Fig.2 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on pathologic changes in lung tissues in asthmatic mice(×200)

圖3 樺褐孔菌多糖BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的影響Fig.3 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on Th2 cytokines such as IL-4，IL-5，IL-13 in bronchoalveolar lavage fluids of asthmatic miceNote: #.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

2.4PIO降低哮喘氣道重構(gòu)小鼠AHR。如圖4所示，與對照組相比，模型組小鼠乙酰膽堿霧化后的氣道反應(yīng)性明顯升高；但是PIO的干預(yù)可以抑制哮喘氣道重構(gòu)小鼠的氣道高反應(yīng)(P<0.05)。

2.5PIO通過調(diào)控PI3K/AKT/NF-κB/MMP-9抑制哮喘氣道重構(gòu)。Western blot結(jié)果顯示，模型組中p-PI3K和p-AKT表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而PIO能夠降低哮喘氣道重構(gòu)小鼠肺組織p-PI3K和p-AKT的表達(dá)，并呈劑量依賴(P<0.05)(圖5A)。如圖5B所示，模型組中，NF-κB的核轉(zhuǎn)移以及MMP-9表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。PIO干預(yù)能夠降低哮喘氣道重構(gòu)小鼠肺組織NF-κB的核轉(zhuǎn)移以及MMP-9的表達(dá)水平(P<0.05)。MMP-9的ELISA檢測結(jié)果表明，與模型組相比，PIO干預(yù)后均下調(diào)哮喘氣道重構(gòu)小鼠BALF中MMP-9的表達(dá)(圖5C)。

2.6PIO對哮喘氣道重構(gòu)小鼠WNT 5A表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果顯示，模型組中WNT 5A表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而PIO能夠降低哮喘氣道重構(gòu)小鼠肺組織WNT 5A的表達(dá)(P<0.05)(圖6)。

圖4 樺褐孔菌多糖對氣道高反應(yīng)性的影響Fig.4 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on airway hyperresponsiveness in asthmatic miceNote: #.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

圖5 樺褐孔菌多糖對PI3K/AKT/NF-κB/MMP-9表達(dá)的影響Fig.5 Effect of polysaccharide from inonotus oblipu-us on PI3K/AKT/NF-κB/MMP-9 signaling pat-hway in asthmatic miceNote: A.WB of PI3K and Akt in lung tissue;B.WB of NF-κB and MMP-9 in lung tissue;C.ELISA of MMP-9.#.P<0.05 vs CON；*.P<0.05 vs OVA.

圖6 樺褐孔菌多糖對WNT 5A表達(dá)的影響Fig.6 Effect of polysaccharide from inonotus oblipuus on expression of WNT 5A in asthmatic miceNote: #.P<0.05 vs CON;*.P<0.05 vs OVA.

3 討論

氣道重構(gòu)的病理學(xué)特征是由于膠原蛋白沉積，杯狀細(xì)胞增生，氣道平滑肌厚度增加，新生血管增多等導(dǎo)致的上皮增厚[1]。目前哮喘的治療主要是使用吸入性皮質(zhì)類固醇。雖然這些藥物在抗哮喘炎癥方面非常有效，但它們在調(diào)節(jié)氣道重構(gòu)方面效果十分有限，并且長時間高劑量使用時會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。從樺褐孔菌中提取的多糖具有抗氧化性能，可用于自由基清除和抗炎治療，并且無副作用，已成為食品和藥品研究的重點[8]。本研究結(jié)果表明，PIO能夠抑制氣道重構(gòu)小鼠肺組織病理學(xué)改變，炎癥細(xì)胞浸潤，氣道高反應(yīng)性，BALF中細(xì)胞因子的水平。這一結(jié)果表明，PIO對于哮喘氣道重構(gòu)具有抑制作用。接下來我們又探討了PIO抗氣道重構(gòu)可能的作用機(jī)制。PI3K通過調(diào)節(jié)基礎(chǔ)細(xì)胞反應(yīng)，包括增殖、分化和細(xì)胞遷移，在各種炎癥細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。Takeda等[9]研究表明，在PI3Kγ缺陷小鼠中，炎性細(xì)胞積聚、氣道重構(gòu)和氣道高反應(yīng)性等現(xiàn)象明顯緩解。此外，PI3K抑制劑，LY294002和Wortma-nnin均顯示在哮喘模型中發(fā)揮作用[10]。Akt是PI3K的下游效應(yīng)子，是PI3K的直接靶基因，也是該途徑的中心環(huán)節(jié)。通常，Akt磷酸化可以用作PIK3活性的指標(biāo)[11]。作為PI3K/Akt途徑的下游靶標(biāo)，NF-κB是加劇炎性疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[3]。MMP-9是參與哮喘的主要蛋白酶之一，在氣道重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，能夠促使氣道壁膠原沉積，氣道狹窄，因此導(dǎo)致氣道功能障礙。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，p-PI3K、p-Akt和MMP-9的表達(dá)以及NF-κB核轉(zhuǎn)移受到PIO的抑制，而在哮喘氣道重構(gòu)模型中則顯著增加。近年來研究表明，WNT 5A參與激活PI3K信號通路并與哮喘氣道炎癥和氣道重構(gòu)關(guān)系密切，本實驗研究顯示PIO能夠抑制哮喘氣道重構(gòu)小鼠肺組織WNT 5A表達(dá)的增加，暗示W(wǎng)NT 5A可能參與哮喘氣道重構(gòu)。

綜上所述，本研究表明PIO可能通過PI3K/Akt/NF-κB/MMP-9信號抑制哮喘炎癥和氣道重構(gòu)。