吳勤祥 李好朝 喬澤強(qiáng) 賈廷印

(河南南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普通外科二病區(qū),南陽473058)

肝癌是全球六大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。2012年全球新增肝癌病例78.2萬，肝癌死亡人數(shù)約74.5萬[1]。2012年中國(guó)新增肝癌病例42.4萬，肝癌死亡人數(shù)約32.1萬[2]?？梢娭袊?guó)是全球肝癌負(fù)擔(dān)最為嚴(yán)重的地區(qū)。到2013年中國(guó)肝癌死亡人數(shù)約35.8萬，到2015年肝癌死亡人數(shù)增加到42.2萬，肝癌是造成中國(guó)嚴(yán)重疾病負(fù)擔(dān)的惡性腫瘤之一[3,4]。肝癌給患者和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。尋找有效的肝癌治療藥物對(duì)人類健康事業(yè)具有重要意義。柴胡作為一種具有悠久歷史的傳統(tǒng)草藥，來源于柴胡及狹葉柴胡的干燥根，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌、退熱及保肝等功效，在中國(guó)、日本、韓國(guó)等亞洲國(guó)家被廣泛用于流感、發(fā)燒、炎癥、瘧疾等疾病的治療[5]。柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSd)(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1A)是柴胡的主要活性成分之一，屬于多萜類衍生物。柴胡皂苷D在多種癌癥中都呈現(xiàn)了抗癌的作用，如肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及肝癌等[6]。本文主要目的在于探索柴胡皂苷D對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖凋亡和裸鼠肝癌形成的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑 人肝癌細(xì)胞系HepG2來源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。柴胡皂苷D購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit購(gòu)自美國(guó)BD公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。抗Ki67和抗cleaved caspase-3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 HepG2細(xì)胞置于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖到80%左右時(shí)，PBS洗滌后用胰酶消化2 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，1 500 r/min，23℃離心5 min，棄去上清，收集細(xì)胞并立即重懸細(xì)胞，1∶5 傳代培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞分為4組：柴胡皂苷D組(0.1、0.5、1 μmol/L處理)，對(duì)照組用等量的DMSO處理。

1.2.2CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集不同濃度(0、0.1、0.5、1 μmol/L)柴胡皂苷D處理的HepG2細(xì)胞，用已經(jīng)稀釋到10%的CCK-8溶液將各組細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并在37℃培養(yǎng)1～4 h，檢測(cè)450 nm處吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 柴胡皂苷D處理細(xì)胞48 h后，收集各組HepG2細(xì)胞，PBS漂洗后用1×Binding buffer制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。再用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4蛋白印跡 柴胡皂苷D處理細(xì)胞24 h后，用PBS清洗待測(cè)細(xì)胞3次后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解并提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA室溫下封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5小鼠模型建立及藥物處理 4周齡裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。通過皮下注射3×106個(gè)HepG2細(xì)胞建立肝癌小鼠模型。當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)到100～120 mm3時(shí)被認(rèn)為腫瘤形成，并將裸鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、假手術(shù)組和柴胡皂苷D組，每組5只，并開始記錄為實(shí)驗(yàn)的第1天。柴胡皂苷D組進(jìn)行腹腔注射柴胡皂苷D(20 mg/kg)；假手術(shù)組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.6TUNEL染色 頸椎脫臼法處死裸鼠后取肝臟組織用PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊，多聚甲醛(4%)在4°C下固定24 h，PBS清洗后用30%、50%和70%的酒精依次清洗。然后進(jìn)行脫水，再進(jìn)行石蠟包埋切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后于常溫下用蛋白酶K處理15 min。PBS漂洗后滴加TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，37℃暗盒中反應(yīng)1 h。PBS漂洗3次晾干后滴加辣根過氧化物酶結(jié)合的POD于標(biāo)本上，37℃暗盒中反應(yīng)30 min。漂洗后滴加DAB底物，室溫下反應(yīng)10 min。PBS漂洗后蘇木素復(fù)染5 s，自來水沖洗，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕色顆粒的為陽性細(xì)胞。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色 首先肝臟組織的石蠟切片經(jīng)脫蠟再水化后用Triton-100(1%)處理15 min，H2O2(3%)處理15 min。5% 的羊血清封閉30 min，4℃下過夜孵育一抗，第二天加入二抗，37℃孵育30 min。最后進(jìn)行染色封片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為存在明顯差異，P<0.01認(rèn)為存在顯著差異，P<0.001認(rèn)為存在極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1柴胡皂苷D對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 利用CCK-8檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖倍數(shù)。如圖1B所示，0.1 μmol/L的柴胡皂苷D組細(xì)胞增殖倍數(shù)與對(duì)照組無明顯差異。0.5 μmol/L和1 μmol/L的柴胡皂苷D處理HepG2細(xì)胞4 d后，細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果說明，中高濃度(0.5 μmol/L和1 μmol/L)的柴胡皂苷D會(huì)抑制HepG2細(xì)胞增殖。

圖1 柴胡皂苷D化學(xué)結(jié)構(gòu)式(A)和CCK-8檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖(B)Fig.1 Chemical structure of saikosaponin D(A) and proliferation of HepG2 was detected by CCK-8(B)Note: *.P<0.05 vs.control group.

2.2柴胡皂苷D可促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡 通過流式細(xì)胞術(shù)分析柴胡皂苷D對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。Q4象限代表早期凋亡的細(xì)胞，Q2象限代表的是晚期凋亡的細(xì)胞。由圖2可知，0.1 μmol/L的柴胡皂苷D組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L的柴胡皂苷D組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明，柴胡皂苷D能提高HepG2細(xì)胞凋亡。

2.3柴胡皂苷D對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 用蛋白印記檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡標(biāo)記蛋白Ki67和cleaved caspase-3的表達(dá)。圖3顯示，0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的柴胡皂苷D組Ki67表達(dá)明顯低于對(duì)照組，cleaved caspase-3表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，1 μmol/L的柴胡皂苷D組Ki67表達(dá)顯著下降，cleaved caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.01)。由此可見，柴胡皂苷D可減弱細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白的表達(dá)，并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白的表達(dá)。

2.4柴胡皂苷D會(huì)抑制裸鼠肝癌腫瘤形成，提高存活率 通過測(cè)量肝腫瘤體積及統(tǒng)計(jì)裸鼠存活率，分析柴胡皂苷D對(duì)裸鼠肝癌形成及存活率的影響。圖4A顯示，假手術(shù)組裸鼠腫瘤體積與對(duì)照組無明顯差異，柴胡皂苷D組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組(P<0.05)。由圖4B可知，對(duì)照組和假手術(shù)組裸鼠存活率無明顯差異。腫瘤形成的21 d之內(nèi)柴胡皂苷D組裸鼠存活率維持在100%，在腫瘤形成的24 d后存活率急劇降低，約下降30%。上述結(jié)果表明，柴胡皂苷D可抑制肝癌腫瘤的生長(zhǎng)，提高存活率。

2.5柴胡皂苷D可提高肝癌腫瘤組織細(xì)胞凋亡 利用TUNEL染色檢測(cè)肝癌腫瘤組織細(xì)胞凋亡。如圖5所示，假手術(shù)組與對(duì)照組腫瘤組織中凋亡小體數(shù)目無明顯差異，柴胡皂苷D組凋亡小體數(shù)目極顯著地高于對(duì)照組(P<0.001)。以上結(jié)果說明，柴胡皂苷D會(huì)促進(jìn)肝癌腫瘤組織細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡Fig.2 Apoptosis of HepG2 was measured by flow cytometryNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs.control group.

2.6柴胡皂苷D對(duì)肝癌腫瘤組織增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 免疫組化檢測(cè)肝癌腫瘤組織增殖和凋亡標(biāo)記蛋白Ki67和cleaved caspase-3的表達(dá)。

圖6顯示，對(duì)照組和假手術(shù)組腫瘤組織Ki67和cleaved caspase-3表達(dá)水平無明顯差異。與對(duì)照組相比，柴胡皂苷D組腫瘤組織Ki67表達(dá)顯著減弱，cleaved caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。以上結(jié)果說明，柴胡皂苷D可降低腫瘤組織細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白的表達(dá)，并提高腫瘤組織細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白的表達(dá)。

圖3 蛋白印跡檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in HepG2 were tested by Western blotNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs.control group.

圖4 腫瘤體積(A)、小鼠存活率(B)檢測(cè)和腫瘤照片F(xiàn)ig.4 Tumor volume(A),survival (B) detection and photograph of tumorNote: *.P<0.05 vs.control group.

圖5 TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡Fig.5 Apoptosis of tumors were detected by TUNEL stainingNote: ***.P<0.001 vs.control group.

圖6 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織增殖凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in tumors were measured by immunohistochemical stainingNote: **.P<0.01 vs.control group.

3 討論

目前對(duì)肝癌的治療可分為早中晚三個(gè)時(shí)期的治療，每個(gè)階段都有不同的治療方法。對(duì)還保有肝功能且無門靜脈高壓癥的早期肝癌患者一般選擇手術(shù)切除，對(duì)重度肝硬化的早期肝癌患者則需要肝移植。中期肝癌患者一般需要進(jìn)行經(jīng)動(dòng)脈栓塞治療或放射性栓塞治療。晚期肝癌患者大部分都不再適合外科手術(shù)，現(xiàn)階段晚期癌癥治療手段主要包括靶向藥物索拉菲尼的使用，免疫治療及溶瘤病毒治療等[7]。然而這些方法的療效都十分有限，且常常伴有較大的副作用。據(jù)報(bào)道，傳統(tǒng)中藥與常規(guī)癌癥治療的結(jié)合有助于肝癌的治療[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量有利于疾病治療的天然產(chǎn)物。

大量文獻(xiàn)報(bào)道了多種植物提取物具有抑制癌細(xì)胞增殖的功能。有數(shù)據(jù)顯示蘆薈花提取物和貓眼草提取物具有降低肝癌HepG2細(xì)胞增殖的功效[9,10]。Hu等[11]發(fā)現(xiàn)女貞果實(shí)提取物可抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖。據(jù)報(bào)道來源于縷絲花的異葒草苷處理肝癌HepG2細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞增殖能力[12]。有研究表明柴胡皂苷D可抑制晚期前列腺癌CWR22Rv1細(xì)胞增殖[13]。Hu等[14]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D可抑制黑色素瘤A375.S2細(xì)胞增殖。據(jù)報(bào)道在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中，柴胡皂苷D可抑制細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果顯示，中高濃度(0.5和1 μmol/L)的柴胡皂苷D會(huì)抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，降低Ki67的表達(dá)。

越來越多的研究表明許多植物提取物都可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Byambaragchaa等[16]發(fā)現(xiàn)雪蓮乙醇提取物會(huì)增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，上調(diào)cleaved caspase-3表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)閉鞘姜甲醇提取物可增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，提高caspase-3活性[17]。據(jù)報(bào)道芍藥根和丹參根提取物可提高肝癌HepG2和 SMMC-7721細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)cleaved caspase-3表達(dá)[18]。Yao等[19]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D可誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)cleaved caspase-3表達(dá)。有研究表明柴胡皂苷D可提高腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[20]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中，柴胡皂苷D處理可增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，提升cleaved caspase-3表達(dá)[21]。也有報(bào)道柴胡皂苷D可促進(jìn)宮頸癌Hela和乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[22]。本文結(jié)果顯示，柴胡皂苷D能提高HepG2細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)cleaved caspase-3表達(dá)。

大量研究發(fā)現(xiàn)植物提取物可通過抑制腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到抗癌的功效。Huang等[23]通過體內(nèi)研究顯示異槲皮苷可抑制肝癌腫瘤生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道石榴皮提取物可提高二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌小鼠存活率，抑制腫瘤生長(zhǎng)[24]。也有研究表明柴胡皂苷D和阿霉素混合物可降低乳腺癌腫瘤組織的生長(zhǎng)速度[25]。柴胡皂苷D可抑制甲狀腺癌腫瘤的生長(zhǎng)[26]。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷D可下調(diào)肝癌腫瘤組織Ki67表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高存活率。

許多植物提取物在腫瘤組織細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮著積極作用。在二乙基亞硝胺和2-乙酰氨基芴誘導(dǎo)的肝癌大鼠中，黃柏提取物可增強(qiáng)腫瘤組織細(xì)胞凋亡[27]。在用肝癌細(xì)胞H22建立的荷瘤小鼠中，川楝子提取物可增強(qiáng)腫瘤組織細(xì)胞凋亡[28]。Cheng等[29]發(fā)現(xiàn)澤漆乙酸乙酯提取物可誘導(dǎo)肝癌腫瘤組織細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果表明，柴胡皂苷D會(huì)提高腫瘤組織cleaved caspase-3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在肝癌HepG2細(xì)胞中，柴胡皂苷D處理會(huì)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)Ki67表達(dá)，增強(qiáng)cleaved caspase-3表達(dá)。而且，柴胡皂苷D還可抑制肝癌腫瘤組織生長(zhǎng)，提高存活率，綜上所述，柴胡皂苷D具有抑制人肝癌HepG2細(xì)胞系增殖和裸鼠肝癌形成的作用。我們下一步計(jì)劃將通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究柴胡皂苷D對(duì)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。