劉 萍 韓達(dá)斌 馬金華 劉 慧 雷 嬌

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，西寧810001)

肺癌是迄今為止世界上最常見的惡性腫瘤。全世界每年有近百萬人死于肺癌，中國近60萬人死于肺癌及其并發(fā)癥[1,2]。雖然目前在臨床和腫瘤實(shí)驗(yàn)方面取得了很多進(jìn)展，但肺癌的診斷和治療仍不盡如人意，5年總生存率僅為11%[3,4]。其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中的發(fā)病率最高，約占肺腫瘤的85%[5]。由于腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，臨床上對(duì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌的診斷時(shí)機(jī)受到一定的限制[6]。一般而言，化療聯(lián)合手術(shù)切除是非小細(xì)胞肺癌的經(jīng)典治療策略[7]。然而，化療總是伴有一些嚴(yán)重的副作用，如白細(xì)胞減少、肝功能不全和腎功能紊亂[8]。因此，需要更安全的治療策略和更徹底的研究來改善非小細(xì)胞肺癌的治療現(xiàn)狀。

蘆薈苷也被命名為蘆薈酵素(C21H22O9)，是一種天然的生物活性蒽環(huán)類抗生素。通常從蘆薈葉中提取純凈的蘆薈苷[9]。相關(guān)報(bào)告顯示蘆薈苷具有抗炎、抗菌、抗氧化活性，抗病毒和抗癌潛力[10]。此外，之前的研究發(fā)現(xiàn)了蘆薈苷在調(diào)節(jié)人類惡性腫瘤(如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等)細(xì)胞周期阻滯和凋亡中的有效作用。已經(jīng)證明蘆薈苷能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM的侵襲和轉(zhuǎn)移行為[11,12]。上述研究說明了蘆薈苷在抑制惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的潛力。此外，其他研究人員提出，蘆薈苷通過p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)-NF-κB依賴性途徑下調(diào)MMP-2的表達(dá)，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲[13]。從而確定p38是蘆薈苷誘導(dǎo)NSCLC H460細(xì)胞凋亡的重要決定因素。然而，沒有具體研究顯示非甾體抗炎藥物中蘆薈苷的抗癌潛力。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料 蘆薈苷和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)購自美國Sigma公司；p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞獲自武漢大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)物中心。細(xì)胞生長培養(yǎng)條件：10%FBS，50 μg/ml鏈霉素和50 μg/ml青霉素的培養(yǎng)基(MEM)，37℃，5%CO2進(jìn)行孵育。

1.2.2定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) qPCR使用TRIzol試劑盒從非小細(xì)胞肺癌患者和對(duì)照組織中提取總RNA。 用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA有義鏈。然后在Real-time PCR系統(tǒng)中進(jìn)行qPCR反應(yīng)。 U6被視為內(nèi)部控制參數(shù)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火32 s，循環(huán)50次后檢測(cè)其溶解曲線，檢測(cè)完成后，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3測(cè)定細(xì)胞活力 細(xì)胞活力評(píng)估使用MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定。用蘆薈苷處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞24 h后，去除培養(yǎng)基。使用MTT試劑在10%乙醇和0.1%試劑染液中對(duì)其進(jìn)行處理，在室溫下持續(xù)5 min，然后充分漂洗3次。使用95%乙醇提取，使用ELISA讀數(shù)器測(cè)定吸光度。在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，并使用DCM300數(shù)碼相機(jī)拍照顯微鏡，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力數(shù)據(jù)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)FITC-Annexin V/PI雙染色被認(rèn)為是理想的定量測(cè)定細(xì)胞凋亡的方法。將HCT116細(xì)胞以2×106細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中，生長24 h。使用蘆薈苷處理細(xì)胞24 h后，加入100 μl細(xì)胞懸液5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，并將細(xì)胞在黑暗中孵育30 min。 PI(5 μl，濃度為10 μg/ml)加入細(xì)胞，在黑暗中再次孵育10 min。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞以識(shí)別細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞凋亡指數(shù)按照下列公式計(jì)算：PI%=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.2.5細(xì)胞周期分析 細(xì)胞使用胰蛋白酶消化，調(diào)整至5×105～1×106個(gè)細(xì)胞/管，使用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗后，重懸在2 ml的乙醇中。在4℃孵育1 h后，除去乙醇將100 μl核糖核酸酶溶液(10 mg/ml)加入到每個(gè)試管中。然后將試管在室溫下再培養(yǎng)30 min，并加入500 μl的分析溶液(PBS中的37 mmol/L EDTA和0.1%Triton X-100)，然后加入100 μl碘化丙錠溶液(400 μg/ml)。樣品在4℃黑暗中保存，并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.6Western blot 肺癌細(xì)胞在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，在指定的時(shí)間點(diǎn)用熊果苷處理。將樣品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%的Tween20的PBS中加入脫脂奶粉，孵育20 min，稀釋度為1∶1 000的一抗孵育過夜，p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-H2AX、H2AX和GAPDH，然后與IRDye-結(jié)合的二抗在37℃溫育1 h，室溫下充分沖洗后，使用蛋白二抗孵育加強(qiáng)與一抗的蛋白反應(yīng)。蛋白印跡的圖像使用LAS-1000Lumino-圖像分析儀。

2 結(jié)果

2.1蘆薈苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)及濃度選擇 蘆薈苷可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長。為了探討蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性的影響，用不同濃度(0、10、50和100 μmol/L)的蘆薈苷處理非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞。圖1顯示了蘆薈苷的結(jié)構(gòu)。圖2結(jié)果顯示，即使在低濃度(10 μmol/L)時(shí)也測(cè)量到蘆薈苷對(duì)A549細(xì)胞的抗增殖作用(P<0.05)，而較高濃度(50和100 μmol/L)的蘆薈苷更明顯降低了A549細(xì)胞的增殖水平(P<0.001)。結(jié)果顯示，蘆薈苷在較高濃度時(shí)可有效抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞活力。

2.2蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡行為的影響 為了進(jìn)一步研究蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)探討蘆薈苷誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡和G2/M期細(xì)胞周期停滯。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，用10 μmol/L蘆薈苷處理的A549細(xì)胞中沒有檢測(cè)到顯著的細(xì)胞凋亡差異，而50和100 μmol/L蘆薈苷明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01，圖3)。

2.3蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期分析表明，10 μmol/L蘆薈苷引起G2/M期的積累(P<0.05)，50和100 μmol/L蘆薈苷可以明顯誘導(dǎo)G2/M期阻滯，G1期細(xì)胞比例相對(duì)下降，G2期細(xì)胞數(shù)目比例相對(duì)上升(P<0.01，圖4)。表明隨著蘆薈苷藥物濃度升高誘導(dǎo)的周期停滯相應(yīng)明顯(圖4)。上述結(jié)果表明，蘆薈苷可以在一定程度上誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞停滯行為。

2.4蘆薈苷抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移前者的結(jié)果揭示了蘆薈苷的抗活性作用，然后通過Transwell測(cè)定和劃痕試驗(yàn)來研究蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響。

圖1 蘆薈苷的生物分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Biological molecular structure of aloin glycosides

圖2 不同濃度的蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of aloin on activity of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

在A549細(xì)胞中，與加入10 μmol/L的蘆薈苷相比，加入蘆薈苷(50和100 μmol/L)的侵襲性細(xì)胞的數(shù)量減少了2倍以上(P<0.001，圖5)。 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果趨勢(shì)與Transwell測(cè)定一致。 10 μmol/L蘆薈苷組表現(xiàn)出遷移能力增強(qiáng)，而蘆薈苷(50和100 μmol/L)使間隙增大約30%(P<0.01，圖6)。上述結(jié)果提示蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有明顯的抑制作用。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡行為的影響Fig.3 Flow cytometry assay of effect of aloin on apoptosis in non-small cell lung cancer cells

圖4 蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of aloin on cell cycle of non-small cell lung cancer

圖5 蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.5 Effect of aloin on invasion of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

圖6 蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of aloin glycosides on invasiveness of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

2.5蘆薈苷抑制裸鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，蘆薈苷可有效抑制腫瘤形成和腫瘤體積(圖7A)。細(xì)胞增殖標(biāo)志物(Ki-67和PCNA)的水平也在蘆薈苷處理的小鼠組織中明顯降低(圖7B)。上述結(jié)果表明，蘆薈苷可以在體內(nèi)抑制非小細(xì)胞肺癌的腫瘤生長。

圖7 蘆薈苷抑制裸鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長Fig.7 Aloin inhibits growth of non-small cell lung cancer cells in nude miceNote: A.The effect of aloin on the tumorigenicity of non-small cell lung cancer in nude mice;B.Expression levels of related proliferating proteins in tumor of nude mice.*.P<0.05.

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)惡性程度較高的腫瘤類型之一。在中國，45歲以下的肺癌患者的比率相對(duì)較高，非小細(xì)胞肺癌是最常見的肺癌類型[14]。目前，化療聯(lián)合手術(shù)切除是NSCLC治療中最常用的方法。然而，肺癌的治療仍不能令人滿意，副作用和復(fù)發(fā)多。因此深入了解非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要[15]。近年來，天然草藥產(chǎn)品由于其抗腫瘤活性，包括凋亡誘導(dǎo)和抗增殖活性而被用于治療癌癥。例如，根皮素誘導(dǎo)NSCLC A549細(xì)胞的凋亡[16]?？鄥A通過激活p38促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[17]。這些天然化合物有效地限制了惡性腫瘤的增殖，副作用小。

本研究中使用的蘆薈苷是一種從蘆薈中提取的天然化合物，已被證實(shí)在各種類型的惡性腫瘤中具有有效作用[17]。先前的研究證明，蘆薈苷通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)受體2和STAT3磷酸化的活化[18]，可以顯著抑制體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的增殖，遷移和脈管形成。同樣，在本研究中，蘆薈苷有效地抑制細(xì)胞生長和增殖標(biāo)志物(Ki-67和PCNA)的表達(dá)，特別是在較高濃度(50和100 μmol/L)時(shí)。這些結(jié)果表明蘆薈苷可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的存活能力。

相應(yīng)的研究已經(jīng)報(bào)道了蘆薈苷的抗腫瘤存作用。有報(bào)道表明，蘆薈和化療聯(lián)合應(yīng)用可以提高腫瘤消退率和生存期的有效性[19]。有研究指出，蘆薈苷和大黃素聯(lián)用可以通過線粒體膜電位破壞促進(jìn)人U87惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡行為進(jìn)展[20]。在本研究中，用蘆薈苷處理的肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞活力大大降低，隨著濃度的增加，抑制率增加。此外，蘆薈苷可以提升A549細(xì)胞的凋亡率，誘導(dǎo)G2/M期的積累。這與之前Alshatwi等[21]研究蘆薈苷與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、caspase-8和caspase-9)的表達(dá)增加以及細(xì)胞周期關(guān)卡蛋白(p27、p53和細(xì)胞周期蛋白A)水平的改變趨勢(shì)相一致，進(jìn)一步證實(shí)了蘆薈苷在A549細(xì)胞中的活性作用。上述結(jié)果表明，蘆薈苷可以通過抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期細(xì)胞周期阻滯，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性。同時(shí)蘆薈苷也被認(rèn)為具有抗轉(zhuǎn)移作用。本研究得出了類似的結(jié)論。在蘆薈苷處理下，A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到很大的抑制。前述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在用蘆薈苷處理的A549細(xì)胞中，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-2、MMP-9、MMP-14和VEGF)的水平也降低，特別是在更高濃度(50和100 μmol/L)時(shí)[22]，以上結(jié)果提示了蘆薈苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌運(yùn)動(dòng)的整體抑制作用。

同時(shí)蘆薈苷在體內(nèi)也表現(xiàn)出腫瘤抑制作用。蘆薈苷已被報(bào)道可以直接抑制前列腺癌細(xì)胞在無胸腺裸鼠模型中的生長[23]。體內(nèi)研究注射人HER-2模擬物后，裸鼠腫瘤中顯示蘆薈苷抗腫瘤活性的陽性結(jié)果，證實(shí)蘆薈苷可以明確抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖生長[24]。在高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤B16-F10細(xì)胞中也觀察到蘆薈苷可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲行為[25]。在這項(xiàng)研究中，有效的蘆薈苷濃度可以干擾異種移植物中的腫瘤形成和腫瘤體積。此外，蘆薈苷也可以抑制增殖標(biāo)志物(Ki-67和PCNA)的表達(dá)水平，針對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-9和VEGF)的表達(dá)水平尚未進(jìn)行梯度濃度實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步探討相關(guān)轉(zhuǎn)移通路途徑和蘆薈苷之間的關(guān)聯(lián)，明確A549細(xì)胞凋亡及G2/M期細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞侵襲行為之間的相互關(guān)聯(lián)。此外，蘆薈苷通過抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，干擾A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力及其水平可能是通過細(xì)胞骨架的轉(zhuǎn)變形成，甚至可能通過抑制p38MAPK/Cdc25B/Hsp27途徑參與肺癌的轉(zhuǎn)移過程[26]。

綜上所述，適合濃度的蘆薈苷可以抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲行為，通過前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，蘆薈苷可能干擾病理狀態(tài)下非小細(xì)胞肺癌的疾病進(jìn)展，破壞A549細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的必需途徑，可能引起部分腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，有可能為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和進(jìn)展提供參考意見。