李慧敏 王曉霞 武美麗 金莉婭 苗麗娟 孫 禮

(甘肅省婦幼保健院生殖內(nèi)分泌科，蘭州730050)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率上升，且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)，給女性的生命健康造成嚴(yán)重的威脅[1]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，涉及表觀遺傳學(xué)和免疫學(xué)改變、癌基因的激活和抑癌基因失活等，因此，尋找有效的宮頸癌診療靶點(diǎn)具有重要意義。神經(jīng)纖毛蛋白(Neuropilin，NRP)是一種細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白，因在神經(jīng)發(fā)育方面的作用而被認(rèn)識(shí)，也因此而得名，有NRP1和NRP2兩個(gè)成員，NRP1主要在神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等的細(xì)胞膜表面表達(dá)，屬于非酪氨酸激酶輔助受體，是VEGF的共受體，能夠與其結(jié)合促進(jìn)血管新生及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2,3]。已有研究顯示，多種惡性腫瘤中NRP1出現(xiàn)過表達(dá)，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]。目前NRP1在宮頸癌中的研究相對(duì)較少，有研究顯示，宮頸癌中NRP1的表達(dá)升高，其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)[7]，但關(guān)于NRP1對(duì)宮頸癌生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究尚未清楚。Wnt信號(hào)通路是一類保守的信號(hào)通路，與包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其激活可促進(jìn)腫瘤發(fā)展[8]。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默宮頸癌細(xì)胞中NRP1的表達(dá)，試圖研究其對(duì)癌細(xì)胞活力、凋亡、免疫抑制因子表達(dá)及Wnt信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑和儀器 人正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7 及宮頸癌Hela、CaSki、SiHa、HCC94細(xì)胞均購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、雙抗均購自美國Gibco；胰蛋白酶購自南京凱基生物；NRP-1、TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1抗體均購自美國Abcam；CCK8試劑盒購自DoJINDO；Bradford試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；DCFH-DA購自美國Sigma；酶標(biāo)儀購自美國Thermo；流式細(xì)胞儀購自美國BIO-RAD。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa和HCC94細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液(含有10%小牛血清及雙抗)，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。每?jī)商鞂⒓?xì)胞培養(yǎng)基更換一次，胰酶消化后傳代。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 NRP-1的特異性干擾序列(NRP-1-siRNA)及無意義siRNA系列(NC-siRNA組)均委托廣州銳博生物設(shè)計(jì)并合成，通過LipofectamineTM2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天以每孔1 ml細(xì)胞懸液(約1×105個(gè)細(xì)胞)接種CaSki細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞達(dá)60%生長(zhǎng)密度時(shí)，換為無血清和抗生素的培養(yǎng)液，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明將NRP-1-siRNA和NC-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，并設(shè)置空白對(duì)照組(Control組)，僅加入脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格參照轉(zhuǎn)染說明，轉(zhuǎn)染后于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)5～6 h，換為含血清和無抗生素培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中NRP-1的蛋白表達(dá)。

1.2.3Western blot 在生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa和HCC94細(xì)胞及轉(zhuǎn)染NRP-1-siRNA后48 h的CaSki細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞裂解液，置于冰上反應(yīng)30 min，離心收集總蛋白。Bradford試劑盒測(cè)定蛋白濃度；蛋白與上樣緩沖液充分混勻后于100℃變性5 min，加50 μg變性蛋白在每孔道中行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后切下目的膠轉(zhuǎn)PVDF膜，將轉(zhuǎn)好的膜在5%濃度的脫脂奶粉中封閉2 h，洗膜，4℃孵育稀釋好的NRP-1、TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1抗體過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)曝光并保存圖像。

1.2.4CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 以每孔中100 μl(1×105ml-1)接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的CaSki細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后將NRP-1-siRNA和NC-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照組(Control組)，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染的48 h在每個(gè)待測(cè)孔中加入CCK8試劑10 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值(OD值)，以O(shè)D值反映細(xì)胞活力，可以間接反映出細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)使用Annexin V-FITC和PI進(jìn)行熒光染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化后將細(xì)胞懸浮于500 μl的Binding緩沖液中，混勻后加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl 的PI，室溫避光環(huán)境孵育10～15 min，上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS含量 PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞懸浮于含DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)液中，37℃孵育20 min，以無血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，將沒有進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA去除掉，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm和525 nm)，由于熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈現(xiàn)出正相關(guān)，因此可以熒光強(qiáng)度大小反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1NRP-1在宮頸癌細(xì)胞表達(dá) 以人正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7 為對(duì)照細(xì)胞，Western blot檢測(cè)宮頸癌Hela、CaSki、SiHa、HCC94細(xì)胞NRP-1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa、HCC94細(xì)胞NRP-1的蛋白表達(dá)分別為(0.092±0.010)、(0.245±0.032)、(0.473±0.041)、(0.337±0.038)、(0.316±0.033)，NRP-1在宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)均顯著高于在Ect1/E6E7 細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.05)。

2.2NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞效果 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞48 h， Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中NRP-1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組NRP-1的蛋白表達(dá)分別為(0.312±0.032)、(0.324±0.036)、(0.090±0.009)，NRP-1-siRNA組NRP-1的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而在NC-siRNA組的表達(dá)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 NRP-1在宮頸癌細(xì)胞表達(dá)Fig.1 NRP-1 expression in cervical cancer cellsNote: A.Western blot was used to detect the expression of NRP-1 in cervical cancer cells;B.The relative expression of NRP-1 protein in cervical cancer cells;compared with Ect1/E6E7 cells,*.P<0.05.

圖2 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞后NRP-1的蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of NRP-1 after NRP-1-siRNA was transfected into CaSki cellsNote: A.The protein expression of NRP-1 in CaSki cells transfected with NRP-1-siRNA were detected by Western blot;B.The relative expression of NRP-1 protein;compared with the Control group,*.P<0.05.

2.3NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染降低CaSki細(xì)胞活力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞活力及凋亡率檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組的OD值分別為(0.683±0.065)、(0.669±0.062)、(0.321±0.037)，凋亡率分別為(2.01±0.32)%、(2.12±0.38)%、(11.83±0.87)%，與對(duì)照組比較，NRP-1-siRNA組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.4NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)CaSki細(xì)胞ROS產(chǎn)生 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中相對(duì)熒光強(qiáng)度，由于熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈現(xiàn)出正相關(guān)，因此可以熒光強(qiáng)度大小反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，結(jié)果如圖4所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組ROS水平分別為(16.6±1.02)、(18.1±1.11)、(34.3±1.85)，與對(duì)照組比較，NRP-1-siRNA組ROS水平顯著升高(P<0.05)。

2.5NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染降低CaSki細(xì)胞免疫抑制因子TGF-β1表達(dá) Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組TGF-β1的蛋白表達(dá)分別為(0.362±0.042)、(0.374±0.045)、(0.153±0.016)，與對(duì)照組比較，NRP-1-siRNA組TGF-β1的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖3 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CaSki細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of NRP-1-siRNA transfection on viability and apoptosis in CaSki cellNote: A.The OD value of each cell;B.The results of cell apoptosis detection in each group;C.Cell apoptosis rate in each group;compared with Control group,*.P<0.05.

圖4 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CaSki細(xì)胞ROS含量的影響Fig.4 Effect of NRP-1-siRNA transfection on the content of ROS in CaSki cellsNote: Compared with the Control group,*.P<0.05.

圖5 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CaSki細(xì)胞免疫抑制因子TGF-β1表達(dá)的影響Fig.5 Effect of NRP-1-siRNA transfection on the expression of immunosuppressive factor TGF-β1 in CaSki cellNote: A.Western blot was used to detect the protein expression of TGF-β1;B.The relative expression of TGF-β1 protein;compared with the Control group,*.P<0.05.

2.6NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)Wnt信號(hào)通路表達(dá) Western blot檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖6所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組Wnt1的蛋白表達(dá)分別為(0.756±0.075)、(0.773±0.072)、(0.192±0.023)，β-catenin的蛋白表達(dá)分別為(0.342±0.034)、(0.359±0.036)、(0.123±0.015)，Survivin的蛋白表達(dá)分別為(0.187±0.021)、(0.177±0.020)、(0.103±0.013)，Cyclin D1的蛋白表達(dá)分別為(0.211±0.018)、(0.205±0.019)、(0.148±0.013)，與對(duì)照組比較，NRP-1-siRNA組Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

圖6 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響Fig.6 Effect of NRP-1-siRNA transfection on Wnt signaling pathwayNote: A.Western blot was used to detect the expression of Wnt signaling pathway protein;B.The relative expression of Wnt signaling pathway protein;compared with Control group,*.P<0.05.

3 討論

RNA干擾技術(shù)是一種能有效沉默基因表達(dá)的方法，具有高度特異性、高效性及濃度和時(shí)間依賴性等特點(diǎn)，較其他傳統(tǒng)的基因沉默方法有著更多的優(yōu)勢(shì)，目前已成為基因治療、基因功能研究的一個(gè)重要工具[9-11]。在基因治療宮頸癌的研究中，采用RNA干擾技術(shù)特異的抑制一些原癌基因的表達(dá)可有效降低宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[12,13]。NRP-1基因有廣泛的表達(dá)，在幾乎人類所有的惡性腫瘤組織中有表達(dá)，既可以在腫瘤細(xì)胞上直接分布，也可在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上分布，在多種腫瘤中出現(xiàn)過表達(dá)，其過表達(dá)可增加腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而也有研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾技術(shù)抑制NRP-1的表達(dá)可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14,15]。乳腺癌中通過RNA干擾技術(shù)抑制NRP-1的表達(dá)可降低癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高其對(duì)表柔比星的敏感性，而過表達(dá)反之；RNA干擾沉默腦膠質(zhì)瘤中NRP-1的表達(dá)后可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期[16]。NRP-1對(duì)宮頸癌的影響研究尚未清楚。有研究顯示，宮頸癌中NRP1的表達(dá)升高，其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床分期有關(guān)[7]。因此本試驗(yàn)旨在研究NRP1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

本研究首先檢測(cè)不同宮頸癌細(xì)胞中NRP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CaSki細(xì)胞中NRP1的表達(dá)最高，因此選擇其作為研究對(duì)象，通過RNA干擾技術(shù)抑制CaSki細(xì)胞NRP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NRP1-siRNA組NRP1的表達(dá)明顯降低，說明可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。CCK8法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NRP1-siRNA組細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率升高。人體正常情況下，ROS產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而一些病理因素，可打破其平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，多項(xiàng)研究表明，ROS產(chǎn)生與多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)[17-20]。本研究的結(jié)果提示抑制宮頸癌中NRP1的表達(dá)可通過提高ROS含量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Wnt信號(hào)通路是一類保守的信號(hào)通路，目前Wnt信號(hào)經(jīng)典通路Wnt/β-catenin及下游的靶基因成為研究熱點(diǎn)。當(dāng)Wnt被過度激活時(shí)可引起β-catenin大量積聚在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可引起Survivin、Cyclin D1等下游與腫瘤相關(guān)靶基因的激活，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生增殖過度，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[21,22]。多項(xiàng)研究顯示，宮頸癌、腎癌等多種腫瘤中Wnt信號(hào)被激活，可促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展，而通過Wnt信號(hào)通路抑制劑抑制其表達(dá)可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展[23,24]。TGF-β在機(jī)體正常發(fā)育及腫瘤發(fā)生中有重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1具有重要的免疫抑制作用，其在宮頸癌中的大量分泌可逃脫免疫反應(yīng)的攻擊[25]。宮頸癌中TGF-β1的表達(dá)升高，Wnt信號(hào)通路可通過促進(jìn)TGF-β的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[26]。本研究結(jié)果顯示，抑制宮頸癌NRP1的表達(dá)可降低Wnt信號(hào)通路Wnt1、β-catenin和下游靶基因Survivin、Cyclin D1及TGF-β1的表達(dá)。這提示NRP1可通過下調(diào)Wnt信號(hào)通路降低宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，抑制宮頸癌中NRP-1基因表達(dá)可降低癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低免疫抑制分子TGF-β1表達(dá)，其機(jī)制與提高細(xì)胞ROS水平和下調(diào)Wnt信號(hào)通路有關(guān)。該研究提示NRP-1可能對(duì)宮頸癌的防治具有一定的價(jià)值，但需更多的研究及臨床試驗(yàn)作為支撐。