鐘春元，陳祚和，邱成旭，楊守東

1.江西省興國縣人民醫(yī)院(興國 342400)，2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院藥劑科(包頭014010)

主題詞 @C11orf 65基因 糖尿病，2型/免疫學(xué) 二甲雙胍 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳學(xué)

我國的患者人群中，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為威脅人民健康的重大慢性病，二甲雙胍在2型糖尿病的治療中具有舉足輕重的地位，它不但能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，而且能夠降低肝糖原的分解、增強(qiáng)肝臟對(duì)葡萄糖的吸收，是目前在全世界的口服降糖藥物當(dāng)中應(yīng)用最廣泛的[1]。但是，即便在患者依從性良好的情況下，臨床中也能觀測(cè)到降糖療效存在著較大的個(gè)體差異。有研究發(fā)現(xiàn)，在規(guī)范使用二甲雙胍的患者中，約有30%的患者降糖患者并不理想[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道C11orf 65基因多態(tài)性與二甲雙胍的降糖效果具有顯著的相關(guān)性[3-4]，但上述研究均在白種患者人群中展開，未在中國人群中得到相關(guān)驗(yàn)證。因此，本研究旨在探索就診于我院的T2DM患者中，其C11orf 65基因rs11212617位點(diǎn)的多態(tài)性與二甲雙胍的臨床降糖效果之間的相關(guān)性，為臨床中二甲雙胍的使用提供借鑒。

資料與方法

1 一般資料 選擇2015年1月至2017年12月就診于我院的新發(fā)T2DM患者，納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為T2DM，要求納組的T2DM患者接受二甲雙胍的單藥治療，而且要保證在后來的12個(gè)月內(nèi)接受臨床的隨訪要求。最終入組180例患者，其中男性100例，女性80例，平均年齡(61.2±9.2)歲，患者的個(gè)體之間無任何親緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：1型糖尿病患者除外；遺傳性糖尿病患者除外；已經(jīng)出現(xiàn)了糖尿病的并發(fā)癥患者除外；患有心腦血管疾病的患者除外；肝腎功能異常的患者除外；正在服用除二甲雙胍外的其它降糖藥物(中藥或其它降糖機(jī)制的化學(xué)藥物)的患者要剔除；在使用二甲雙胍的過程中，如果患者出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)或藥物過敏，應(yīng)從研究中剔除。納入的所有患者或其家屬均要簽署知情同意書。

在患者服用二甲雙胍之前以及12個(gè)月的隨訪結(jié)束的時(shí)候，對(duì)患者的糖化血紅蛋白(HbA1c)水平進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)各患者的HbA1c水平變化幅度，評(píng)價(jià)不同C11orf 65基因型的患者二甲雙胍的降糖療效。

2 血樣收集與DNA的提取 患者的基因型不會(huì)改變，在任意時(shí)間均可采集外周血，采血量約于2ml，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，離心分離血漿及血細(xì)胞。采用市售試劑盒提取基因組DNA(胍鹽酸法)，置于-20℃冰箱中備用。

3 引物、PCR擴(kuò)增及基因分型 采用聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)-限制性長度片段多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技術(shù)分析C11orf 65(rs11212617 C>A)的基因型，上下游引物分別如下：

上游引物：5’-TCCGAGTTTGGCCCTAGCGTCG-3’；

下游引物：5’-GACCATGGACAGCCACACTGAA-3’。

采用Amp 9700 PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA，Perkin Elmer基因)對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行控制。PCR的擴(kuò)增條件：95℃ 進(jìn)行10 min的預(yù)變性，95℃進(jìn)行30s的變性， 58℃進(jìn)行30s的退火，72℃進(jìn)行30s的延伸，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃下10 min結(jié)束本反應(yīng)。PCR的產(chǎn)物采用限制性的內(nèi)切酶Taq I (New England Biolabs, Massachusetts, USA)進(jìn)行酶切。212bp的擴(kuò)增子酶切以后可得到26bp和186bp片段的，即為位點(diǎn)rs11212617的CC基因型，AA基因型能夠保持在212bp，擴(kuò)增子經(jīng)酶切后會(huì)得到26bp、186bp與212bp三個(gè)片段的則為雜合基因型CA，根據(jù)條帶長短與數(shù)量確定患者最終的基因分型。為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)選取了樣本采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證，最終基因分型的成功率是>98.9%的，對(duì)重復(fù)樣本的基因分型結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤的情況。

結(jié) 果

1 C11orf 65基因的多態(tài)性分布頻率 入組的T2DM患者中C11orf 65 rs11212617等位基因頻率為65.0%。C11orf 65 rs11212617基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.16)，這表明了本研究人群C11orf 65 rs11212617基因型分布符合遺傳平衡，入組的患者人群具有很好的代表性。見表1。

表1 T2DM患者中C11orf 65 rs11212617各基因型頻率[例(%)]

2 C11orf 65 rs11212617對(duì)二甲雙胍降糖療效的影響 根據(jù)C11orf 65 rs11212617不同的基因型(CC、CA、AA)將180例入組患者分為CC型、AA型和AA型三個(gè)組別。三種不同基因型攜帶者單用二甲雙胍后HbA1c變化情況有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。攜帶C11orf 65 CC基因型患者接受二甲雙胍單藥治療12個(gè)月以后，HbA1c的下降幅度是(2.69±1.00)%，與AA基因型患者(0.99±0.69)%(P<0.001)和CA基因型患者(1.42±1.22)%比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

3 不同基因型的分組結(jié)果比較 A位點(diǎn)若為純合突變時(shí)，HbA1c的下降幅度最小，CA基因型與CC基因型患者之間的HbA1c下降差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P=0.00246)。單藥治療12個(gè)月以后，CC、CA和AA這三種基因型的患者HbA1c水平變化見表2。二甲雙胍臨床降糖療效與C11orf 65不同基因型之間的相關(guān)性分析見表3。

表2 C11orf 65 rs11212617基因多態(tài)性與二甲雙胍單藥療效的相關(guān)性分析(n=180)

注：12月HbA1c 代表治療并隨訪12個(gè)月后測(cè)量的指標(biāo)；△表示指標(biāo)經(jīng)12個(gè)月治療后的變化程度

表3 C11orf 65 rs11212617不同基因型與二甲雙胍臨床療效的相關(guān)性分析

討 論

除著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與人民生活水平的提高，近年來糖尿病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了我國居民的健康水平，且糖尿病的患病率也顯著的增加，自1980到2013年間，患病率已經(jīng)從0.67%上升到了10.4%。最常見的便為T2DM[5]。在T2DM的治療當(dāng)中，口服降糖藥物治療是最主要的治療方法。隨著藥品的研發(fā)，降糖藥物的種類亦在增加，已經(jīng)從最開始的雙胍類和磺脲類降糖藥，開發(fā)出了多種新型的降糖藥物，如胰島素的增敏劑、α-糖苷酶的抑制劑、二肽基肽酶-4(DPP-4)的抑制劑、GLP-1類似物等不同類型的藥物。但是二甲雙胍依然是單藥治療中的首選，得到了2017年中國T2DM防治指南的推薦，即使是在多次注射胰島素時(shí)，對(duì)于肥胖的糖尿病患者也可以加用二甲雙胍治療[5]。當(dāng)前，國內(nèi)外的處方中二甲雙胍在仍占有很大比例。

但是，二甲雙胍的臨床療效在不同的患者間卻存在著較大的差異。二甲雙胍有一定的親水性，口服后迅速吸收進(jìn)入血液，并以原型的形式通過腎臟從尿液當(dāng)中排出來[6]，二甲雙胍在人體的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)過程當(dāng)中有多個(gè)不同類型的蛋白直接參與，這些蛋白可能會(huì)影響到藥物的吸收、分布以及排泄過程。C11orf 65為11號(hào)染色體開放閱讀框65的英文簡寫(Chromosome 11 open reading frame 65)，這是一個(gè)蛋白編碼基因，已知對(duì)T細(xì)胞造血干細(xì)胞白血病相關(guān)。目前國際上僅有三篇文章報(bào)道了該基因的位點(diǎn)變異與二甲雙胍的臨床療效相關(guān)[3]，本研究以中國人群為研究對(duì)象，考察該基因的變異對(duì)糖尿病患者接受二甲雙胍單藥治療后的HbA1c下降水平，研究結(jié)果與國外報(bào)道相近，即C11orf 65基因位點(diǎn)發(fā)生變異的患者其對(duì)二甲雙胍的反應(yīng)性降低，而野生型患者的臨床效果較好。

誠然，二甲雙胍的降糖療效不僅受單基因的影響，而是受到了多基因的調(diào)控，除了本研究檢測(cè)的C11orf 65外，還有其它基因的研究報(bào)道。眾所周知，啟動(dòng)子是調(diào)整基因表達(dá)的重要因子，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)MATE1基因的啟動(dòng)子區(qū)g.-66T>C變異致使啟動(dòng)子的活性降低，最終影響了二甲雙胍的降糖療效[6]。此外，OCT(Solute carrier family,SLC22)家族中的OCT1與OCT2(一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，分別分布在上皮細(xì)胞和腎近端小管基底外側(cè)膜中，能夠介導(dǎo)藥物攝入到肝臟和腎小管的上皮細(xì)胞[7]，也會(huì)影響二甲雙胍的臨床降糖效果。ATM基因是一個(gè)與DNA修復(fù)有關(guān)的重要基因，它的基因變異也可能會(huì)影響到二甲雙胍的降糖效果，但目前各項(xiàng)研究仍未得到一致的結(jié)論，還需要進(jìn)一步的深入探索[8]。

綜上所述，C11orf 65基因rs11212617 AA基因型與CA和CC基因型HbA1c在治療前后變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P<0.01)。事先對(duì)C11orf 65基因rs11212617位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，能夠幫助我們預(yù)判二甲雙胍降糖療效，對(duì)臨床的安全有效用藥具有一定的參考價(jià)值。