文婷婷,陳亞芳△,戴 娜,沈正林,王建軍,楊 勇,王 婷

1.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室(昆山215300)，2. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院消化內(nèi)科(昆山215300)，3. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院檢驗(yàn)科(昆山215300)，4．江蘇大學(xué)研究生院外科學(xué)(鎮(zhèn)江 212013)，5. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院門診藥房(昆山215300)

主題詞 幽門螺桿菌 細(xì)菌感染/診斷

自1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(WHO/IARC)將幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)定為Ⅰ類致癌原以來[1]，HP的研究一直備受關(guān)注。HP與多種消化道疾病有關(guān)，例如慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、非潰瘍性消化不良、胃癌及胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤等，甚至胃腸外疾病[2]。HP感染的臨床檢測方法主要分為侵入性與非侵入性兩種。侵入性檢測有一定創(chuàng)傷性，凝血功能差、服用抗凝藥物的患者或者患兒依從性較差；而非侵入性檢測方法創(chuàng)傷性較小，彌補(bǔ)了侵入性檢測依從性差的不足[3-5]。本文對現(xiàn)有的HP感染臨床檢測方法進(jìn)行系統(tǒng)性總結(jié)，比較臨床應(yīng)用中各方法的優(yōu)勢與缺點(diǎn)。

1 侵入性HP感染檢測方法

侵入性HP檢測方法均需事先進(jìn)行胃鏡下活檢，取樣后進(jìn)行后續(xù)分析。主要有下列幾種：

1.1 分離培養(yǎng)及涂片 原理：將活檢標(biāo)本取材后送檢驗(yàn)室制勻漿，然后使用固體或液體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入1 %～10 %動(dòng)物血清及選擇抗生素(萬古霉素或多粘菌素等)，在微需氧(5%O2)37℃條件下培養(yǎng)3～5d，需要時(shí)，可延長至1～2周。制片形態(tài)為革蘭染色陰性、S狀彎曲或短桿菌，暗視野或相差顯微鏡下有典型鉆探樣運(yùn)動(dòng)。此法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，是HP感染的確切證據(jù)。但該方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、周期長。

1.2 組織學(xué)染色和組化染色 使用常規(guī)病理切片進(jìn)行染色。在油鏡下HP呈典型的S狀或海鷗狀彎曲，位于粘膜層表面或侵入胃腺窩部或在上皮細(xì)胞連接處。根據(jù)部位與染色，而與一般雜菌鑒別開。此法為HP診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一。

1.3 快速尿素酶試驗(yàn)法(RUT) 原理 HP為人胃內(nèi)唯一產(chǎn)生大量尿素酶的細(xì)菌，因此可通過檢測尿素酶來診斷HP感染。取病變處黏膜胃竇黏膜組織1塊，利用快速尿素酶診斷試劑盒進(jìn)行檢測。將黏膜組織加入含有酚紅的尿素酶試劑之中，于10 ～30 ℃下靜置5 min后觀察最終結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：最終顏色為黃色則視為陰性，為玫瑰色或者淺紅色則視為陽性[6]。

2 非侵入性HP感染檢測方法

非侵入性HP檢測方法無需做胃鏡檢查，更易被老年人、兒童所接受。主要有下列幾種：

2.113C-尿素呼氣試驗(yàn)(13C-UBT) 檢測原理：患者口服含有13C同位素標(biāo)記的尿素，通過HP代謝產(chǎn)生的尿素酶將其分解，并產(chǎn)生13CO2。根據(jù)患者呼出氣體的13C含量，判斷受試者是否感染HP[2]。臨床上常將此法作為診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。結(jié)果多以DOB表示。

2.214C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-UBT) 檢測原理：與13C-UBT類似，借助HP代謝尿素酶分解尿素為CO2與氨的特性，給患者服用14C-尿素膠囊，患者呼氣過程中有14C標(biāo)記的14CO2排出，通過檢測是否存在14CO2，即可確定HP存在與否[7]。

2.315N-尿氨排出試驗(yàn)(15N-UDT) 檢測原理：依據(jù)HP代謝尿素酶的特性，15N標(biāo)記的尿素經(jīng)過尿素酶代謝產(chǎn)生15N標(biāo)記NH3，然后經(jīng)過肝臟、腎臟代謝為尿液排出體外。通過尿液收集，即可知是否感染HP[8-9]。受代謝途徑的限制，嚴(yán)重肝腎損傷的患者不宜使用。

2.4 膠體金法 此法常用于檢測口腔中HP感染——唾液HP抗原檢測法(HPS)[10]。原理：唾液中的HP代謝生成的尿素酶可與膠體金標(biāo)志物結(jié)合，而膠體金移動(dòng)至特定區(qū)域又與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，聚集在檢測帶上，可直觀目測到顯色結(jié)果。盡管HPS是否作為口腔HP感染首選檢測手段尚未經(jīng)過驗(yàn)證，但膠體金法操作簡便，靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性較高，結(jié)果直觀易得，有廣泛應(yīng)用前景。

2.5 分子生物學(xué)技術(shù) 采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行分子層面的改造，獲得所需要的產(chǎn)物并進(jìn)行分析。主要有以下幾種：

2.5.1 PCR技術(shù)：定向擴(kuò)增HP特異功能基因(如尿素酶A、B結(jié)構(gòu)亞單位等)或結(jié)構(gòu)基因，設(shè)計(jì)專用引物，在一定條件下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，然后將產(chǎn)物進(jìn)行探針雜交等特異性檢測[11]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)包括Taqman探針法和SYBR Green熒光染料摻入法。和一般PCR相比，能夠?qū)?xì)菌核酸進(jìn)行定量檢測，但其開展需要昂貴的熱循環(huán)儀，限制了在臨床上的應(yīng)用[12]。PCR擁有超過95%的特異性與敏感性，適用于檢測消化道出血的患者。此外，PCR具有檢測快速、需要原始菌量少的特點(diǎn)，可作為臨床上重要的輔助檢測手段。

2.5.2 ELISA技術(shù)：原理：使用特定酶標(biāo)記抗原或抗體，與待測物反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物，然后顯色。是一種操作簡單、廉價(jià)的非侵入性診斷HP感染的方法，常見的檢驗(yàn)樣本有血清、糞便、唾液等[13-14]。但往往存在不能區(qū)分是否為現(xiàn)時(shí)還是既往感染的缺點(diǎn)，多被用于流行病學(xué)與回顧性研究。其中，糞便HP抗原檢測(HPSAT)應(yīng)用較廣泛，在大規(guī)模篩查HP感染和根除HP后隨訪中具有重要價(jià)值[15]。

2.5.3 環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)：該技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增[5,16]。與常規(guī)PCR相比，操作簡單，兼具高特異性與靈敏度，對儀器的要求較低，結(jié)果可通過肉眼直觀判斷。適合用于臨床快速診斷HP是否感染。

2.5.4 活細(xì)胞原位熒光雜交技術(shù)(FIVH)：該技術(shù)以原位雜交熒光技術(shù)(FISH)為基礎(chǔ)，建立的新型檢測方法。制備熒光標(biāo)記的核苷酸探針，與相應(yīng)靶細(xì)胞中的DNA或RNA分子雜交，通過觀察熒光信號，可判斷靶細(xì)胞中細(xì)胞器的形態(tài)與分布。具有反應(yīng)時(shí)間短、易操作的特點(diǎn)，敏感性與特異性也可達(dá)到分析需求[17]。

2.5.5 蛋白芯片法： 同時(shí)檢測多種HP的相關(guān)抗體，如Ure、CagA、VacA等，操作簡便，價(jià)格低廉，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測[18]。其中，Ure、CagA抗體陽性對診斷HP感染有較高的臨床價(jià)值。本法適用于流行病學(xué)調(diào)查研究，通過分析感染者相關(guān)抗體的分型，可以預(yù)測HP的感染。本法對于HP感染的診斷具有較高應(yīng)用前景。

3 各種HP檢測方法的比較

近幾年主要的HP檢測方法研究狀況見表1。

表1 近幾年主要的HP檢測方法研究狀況

細(xì)菌培養(yǎng)是診斷HP感染最可靠的方法，其特異性可達(dá)到100%[23]，為臨床公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。影響此法準(zhǔn)確性的因素包括：樣本取材大小、數(shù)量與部位、染色方法、抗生素與質(zhì)子泵抑制劑的使用、臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等[24]。由于此法在微需氧且無菌環(huán)境下進(jìn)行3～5 d恒溫培養(yǎng)，對檢驗(yàn)技術(shù)的要求高，耗時(shí)過長，難以滿足常規(guī)檢驗(yàn)的需求。而且患者需事先進(jìn)行纖維胃鏡，對于凝血功能較差、兒童與老年人來說并不適合，種種因素限制了其在臨床的應(yīng)用。

RUT法因試劑廉價(jià)、反應(yīng)速度快、操作方便等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床，在胃鏡檢查時(shí)被列為首選。但該方法不可避免地受到環(huán)境溫度、反應(yīng)時(shí)間、細(xì)菌密度及藥物的影響，取材也受HP 在胃“灶性分布”的影響，其敏感性和特異性低。HP產(chǎn)生的尿素酶同為其定值所必需。尿素酶的同工酶有內(nèi)、外尿素酶兩種，內(nèi)尿素酶具有維持HP穩(wěn)定的作用。胃內(nèi)pH上升會導(dǎo)致內(nèi)尿素酶活性降低，從而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生[25]。綜合上述原因，RUT檢測時(shí)出現(xiàn)假陽性/陰性次數(shù)較多，需要進(jìn)一步的檢測來確證HP感染。

13C-UBT與14C-UBT均為非侵入性檢測，因?yàn)橐撞僮?，無創(chuàng)，檢測快速的優(yōu)點(diǎn)而廣為各年齡段的患者所接受。二者也被國內(nèi)外專家推薦作為臨床HP感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因?yàn)?3C為自然界天然存在的同位素，而14C具有微弱的放射性，所以對于孕婦、兒童、年老體弱的人群更適合做13C-UBT，在條件允許的情況下可以在短時(shí)間內(nèi)多次檢查。影響UBT準(zhǔn)確性的因素亦有很多，重要的因素包括試餐中是否包含檸檬酸、氣體收集時(shí)間、臨界值設(shè)定等。由于UBT需依賴尿素酶的存在而間接測定HP，而尿素酶并非HP所特有。故盡管進(jìn)行了UBT，試驗(yàn)的結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證來確定。15N-UDT同樣具有UBT的各種優(yōu)勢，15N標(biāo)記尿素?zé)o放射性，對人體并無損害，但15NH3需在肝臟中代謝，經(jīng)過腎臟排出，有嚴(yán)重肝腎損傷者不宜使用。況且質(zhì)譜儀造價(jià)昂貴，標(biāo)本采集時(shí)效性差也限制了其推廣[26]。

ELISA法操作簡單、耗費(fèi)較低、特異性與敏感性較高。其中，血清抗體檢測法通過HP抗體的檢測來診斷HP是否感染。臨床常見的被檢測抗體主要有HP抗體(抗-HPIgG)與CagA毒素抗體(抗-HPCagA)。HP抗體陽性表示的是感染過HP，而CagA毒素抗體陽性是指有毒素產(chǎn)生的HP菌株感染。血清抗體檢測法的準(zhǔn)確性依賴于試劑的抗原選擇。由于不同地區(qū)HP菌株抗原性差異，應(yīng)選擇當(dāng)?shù)亓餍芯昊虿煌M菌株匯總抗原譜，以提高檢測的準(zhǔn)確性[11]。由于此法不能區(qū)分是既往感染還是實(shí)時(shí)感染，常被用于大面積流行病學(xué)研究與回顧性研究。臨床并不常用此法診斷，且不能作為HP是否根除的隨訪依據(jù)。但是此法不受鉍劑、抗生素、PPI、H2受體拮抗劑的影響，而且人體不會接觸放射性14C元素，適合人群更廣，相較于UBT而言更有優(yōu)勢[27]。HPSAT法檢測原理為：HP感染者體內(nèi)，HP代謝產(chǎn)物與死亡菌體的崩解產(chǎn)物會隨著胃粘膜更新脫落到消化道內(nèi)，這些抗原可抵御消化酶類的降解并隨糞便排出。使用酶標(biāo)雙抗體夾心法測定糞便中HP抗原，可間接反映是否感染HP。HPSAT準(zhǔn)確性受糞便性狀、藥物應(yīng)用與檢測時(shí)間影響。腹瀉患者由于糞便中抗原濃度較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；上消化道出血排出黑便的患者，由于交叉反應(yīng)易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[15]。

PCR法檢測HP的常見毒力基因有16S rRNA、ureA、cagA、cagL、vacA等[28]。與其他檢測手段相比，此法對消化道出血的患者同樣適用[11]。PCR方法無需經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)、檢測快速、操作簡便。而且，此法也可以檢測特定位點(diǎn)耐藥基因的突變。Talarico等[29]建立了一種新型的實(shí)時(shí)PCR方法用于檢測HP克拉霉素耐藥基因23S rRNA的突變。這種方法可以檢測野生型合并耐藥等位基因的混合感染，前提是等位基因占據(jù)不超過10%的23S rRNA基因拷貝數(shù)。LAMP為一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，檢測快速，可作為胃鏡檢查的同步輔助檢測手段。齊詩蕊等[5]使用LAMP法進(jìn)行HP檢測，選擇80例胃液作為檢測樣本，其準(zhǔn)確率為98.75%，靈敏度為97.06%，特異度為100%，與13C呼氣試驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?？蛇_(dá)到胃鏡下同步、無創(chuàng)操作、降低患者出血風(fēng)險(xiǎn)的目的。與傳統(tǒng)PCR法相比，LAMP為恒溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間比PCR短，對儀器要求低，可以實(shí)現(xiàn)視覺直觀檢測，而且靈敏度可達(dá)傳統(tǒng)PCR的10倍。此法對臨床實(shí)現(xiàn)高效檢測HP有較大的應(yīng)用價(jià)值。Bakhtiari等[30]選擇26695 ureC基因作為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)過LAMP法擴(kuò)增來檢測HP。每次反應(yīng)的靈敏度為10fg，檢測限達(dá)到了6個(gè)DNA拷貝數(shù)。這意味著在HP的數(shù)量較低的情況下，此法仍然可以準(zhǔn)確地檢測出。

4 小 結(jié)

HP是胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)的感染率很高(我國大于50%)的細(xì)菌[31]，大多數(shù)胃腸道疾病都由其感染引發(fā)[32-33]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)HP亦可能與代謝相關(guān)性疾病(糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等)的發(fā)生有關(guān)[34]。HP的準(zhǔn)確檢測是輔助臨床治療的前提。如今HP非侵入檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度均可達(dá)到70%以上，而侵入性檢測可達(dá)到100%。非侵入性檢測相較于侵入性檢測而言，具有無創(chuàng)、高效、價(jià)格低廉的優(yōu)勢，更易為大眾所接受。新型的檢測手段也正在逐步更新與完善中，如LAMP，F(xiàn)IVH等基因?qū)用娴臋z測，其均具有高準(zhǔn)確性與靈敏度，且可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、直觀檢測。隨著醫(yī)學(xué)檢測手段的不斷進(jìn)步，相信會有更多新技術(shù)應(yīng)用于臨床。