陳艷花 沈興家

(1江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

家蠶(Bombyxmori)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)性昆蟲(chóng)，也是鱗翅目重要的具有中國(guó)特色的模式生物[1]。但是，家蠶培養(yǎng)細(xì)胞系少，目前普及的只有源于卵巢的BmN細(xì)胞[2]，嚴(yán)重影響了其作為模式生物的應(yīng)用。家蠶絲腺是高度特化的器官，具有高效合成蠶絲蛋白的能力。但是，對(duì)于蠶絲蛋白高效合成的分子機(jī)制至今尚未明了。以往一般認(rèn)為家蠶絲腺合成的幾乎是單一的蠶絲蛋白，但是近年的研究表明蠶絲蛋白是一個(gè)非常復(fù)雜的蛋白復(fù)合體[3]。絲腺細(xì)胞培養(yǎng)系的建立，對(duì)于蠶絲蛋白合成和表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究無(wú)疑具有重要的意義。西南大學(xué)曾建立1個(gè)絲腺細(xì)胞系BmSG-SWU1[4]，但目前尚未普遍使用。組織體外培養(yǎng)是將從活體取出的組織給予充足的營(yíng)養(yǎng)，在無(wú)菌等條件下生長(zhǎng)，并維持原有的結(jié)構(gòu)和功能[5]。其在一定程度上可以代表體內(nèi)試驗(yàn)，且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。為了研究家蠶microRNAs對(duì)蠶絲蛋白的表達(dá)調(diào)控，目前使用的BmN細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)分析系統(tǒng)，不能完全代表體內(nèi)的試驗(yàn)，有時(shí)甚至可能得出與體內(nèi)試驗(yàn)相反的結(jié)果。為此，我們嘗試并建立了一種采用TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)5齡2 d幼蟲(chóng)絲腺組織的方法，為研究蠶絲蛋白基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供新的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試家蠶品種 P50，由農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)保存，解除滯育的越年蠶卵或浸酸后的蠶卵于25 ℃催青，孵化后常規(guī)新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 PBS緩沖液，0.10 mM/L，pH 7.2～7.4，Sangon Biotech公司產(chǎn)品。雙抗(青霉素和鏈霉素)，Gibco公司產(chǎn)品；昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100，Applichem公司產(chǎn)品；胎牛血清，Corning公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑EntransterTM-H4000，Engreen北京生物科技有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara(大連)公司產(chǎn)品；熒光定量試劑盒SYBR Green PCR kit，Qiangen公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 20/20 Luminometer熒光素酶檢測(cè)儀，Promega公司產(chǎn)品；DP80型熒光顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；LightCycler?96熒光定量PCR儀，Roche公司(USA)產(chǎn)品；SPX-250型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制 0.01 mM/L，pH6.2的PBS緩沖液配制：取50.0 mL 0.10 mM/L，pH7.2～7.4的PBS緩沖液溶于300.0 mL雙蒸水中，加0.5 mL雙抗，用鹽酸調(diào)pH值至6.2，加雙蒸水定容至500.0 mL，滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TC-100培養(yǎng)基配制：稱(chēng)取22.09 g TC-100培養(yǎng)基和0.35 g NaHCO3溶于800.0 mL滅菌水，鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.2，定容至1.0 L，0.22 μm濾膜過(guò)濾，加100.0 mL胎牛血清和1.0 mL雙抗，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 絲腺解剖 昆蟲(chóng)解剖工具(解剖板、剪刀、鑷子、大頭針等)用75%的乙醇擦洗消毒。選取健康且大小形態(tài)相近的5齡2 d幼蟲(chóng)數(shù)頭，用75%的乙醇進(jìn)行體表消毒，再用滅菌水沖洗去除乙醇。將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在冰上，倒入事先準(zhǔn)備好的PBS緩沖液。用大頭針將家蠶幼蟲(chóng)腹部朝上固定在解剖板上，剪開(kāi)腹部表皮，再用大頭針固定拉開(kāi)的表皮，用鑷子輕輕將絲腺拉出，放入PBS緩沖液中。

1.2.3 絲腺體外培養(yǎng) 將絲腺在75%的乙醇中快速漂洗，再用PBS緩沖液沖洗2～3次。放入每孔含有800 μL TC-100培養(yǎng)基的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，每孔中4條絲腺組織，置于培養(yǎng)箱中27 ℃培養(yǎng)，根據(jù)需要開(kāi)展轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)表達(dá)研究。

1.2.4 絲腺轉(zhuǎn)染 將4 μL轉(zhuǎn)染試劑與25 μL不完全培養(yǎng)基(不含有血清和抗生素)孵育5 min，0.64 μg增強(qiáng)熒光蛋白基因egfp表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40][6]和25 μL不完全培養(yǎng)基混合，再將2者混合孵育15 min。然后加入到事先放有絲腺組織的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中轉(zhuǎn)染絲腺組織，以不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的絲腺組織為空白對(duì)照，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。再進(jìn)行miR-0031*[7]對(duì)家蠶絲素輕鏈基因BmFib-L表達(dá)調(diào)控試驗(yàn)，將人工合成的miR-0031*的抑制物(inhibitor)和陰性對(duì)照(inhibitor negetive control)各10 μL(200 mmol)按照上述方法孵育和轉(zhuǎn)染，每種處理3個(gè)重復(fù)。48 h后，收集每孔中的絲腺組織，提取總RNA。設(shè)計(jì)上下游引物(BmFib-L F：5′-GATACTCTGTCGGACCAGCC-3′，BmFib-L R：5′-AGCGATGTTGTTGCTTTGGC-3′)，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；再以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR[8]，檢測(cè)不同處理后BmFib-L基因的表達(dá)量，以每100 ng RNA中基因的拷貝數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲腺組織體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染效果觀察

絲腺組織體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染48 h后，分別觀察培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后絲腺組織正常，培養(yǎng)基清澈，絲腺組織狀態(tài)良好(圖1-A)。

A.絲腺組織的狀態(tài)(明場(chǎng))，B. 絲腺組織中egfp的表達(dá)(熒光)，C. 不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的絲腺(熒光)。圖1 轉(zhuǎn)染后48 h絲腺組織體外生長(zhǎng)狀態(tài)和熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]的絲腺組織發(fā)出亮綠色熒光，表明egfp在離體培養(yǎng)的絲腺組織中得到了表達(dá)(圖1-B)；而在不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的絲腺組織(空白對(duì)照)中，未觀察到亮綠色熒光(圖1-C)，即表明沒(méi)有egfp表達(dá)。

2.2 離體培養(yǎng)的絲腺組織BmFib-L表達(dá)水平的qPCR分析

bmo-miR-0031*的inhibitor和 inhibitor negetive control 轉(zhuǎn)染48 h后，qPCR檢測(cè)絲腺組織中BmFib-L基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，inhibitor顯著增強(qiáng)BmFib-L的表達(dá)水平(圖2)，表明miR-0031*能夠下調(diào)BmFib-L的表達(dá)，同時(shí)表明體外培養(yǎng)絲腺進(jìn)行轉(zhuǎn)染等試驗(yàn)是可行的。

圖2 bmo-miR-0031*的抑制物(inhibitor)和陰性對(duì)照(inhibitor negetive control)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的絲腺組織后BmFib-L基因表達(dá)的變化

3 小結(jié)

組織培養(yǎng)即模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)離體組織進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，以研究組織特定條件下或處理后的生理生化、基因表達(dá)等變化，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前植物組織培養(yǎng)被廣泛應(yīng)用，為植物新品種的繁殖推廣帶來(lái)了極大的便利[9]。但是，昆蟲(chóng)等動(dòng)物組織的體外培養(yǎng)研究較少。本試驗(yàn)建立的絲腺組織體外培養(yǎng)，不僅可以為研究家蠶絲腺細(xì)胞生理生化、蠶絲蛋白基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制等提供新的技術(shù)途徑，也可以為家蠶其他組織的體外培養(yǎng)和研究提供借鑒。

試驗(yàn)過(guò)程中使用含有雙抗的PBS緩沖液，目的是在解剖絲腺過(guò)程中，作為平衡營(yíng)養(yǎng)液以防止絲腺吸水或者脫水，也用作后期的漂洗。絲腺放入培養(yǎng)基之前，要用75%的乙醇快速漂洗，動(dòng)作要輕，時(shí)間盡量短，以免傷害組織細(xì)胞；漂洗后再用PBS緩沖液沖洗2～3次，洗去絲腺上附帶的雜質(zhì)以及解剖過(guò)程中產(chǎn)生的污染物。絲腺培養(yǎng)過(guò)程中，可根據(jù)絲腺組織的狀態(tài)，適時(shí)更換培養(yǎng)基。