姬圣潔，沈保華，劉 偉

（1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海200063；2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，上海 200032）

鉤吻（Gelsemium elegans Benth.）別名胡蔓草、斷腸草、大茶藥、毒根等，是馬錢科胡蔓藤屬植物胡蔓藤的全株。在民間，鉤吻以外用為主，具有祛風(fēng)、殺蟲止癢、消腫拔毒的療效。近年來，發(fā)現(xiàn)鉤吻還具有抗腫瘤[1-5]、抗焦慮[6]、消炎止痛[6-8]、免疫調(diào)節(jié)、散瞳[9]等功效。鉤吻素己（gelsenicine）是杜秀寶等人[10]首次從國產(chǎn)鉤吻中提取、分離并測定結(jié)構(gòu)的生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1。高明雅等[3]的研究表明鉤吻中三種生物堿單體鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己都顯示出對肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制活性，其中鉤吻素己的效果最好。劉明等[9]發(fā)現(xiàn)鉤吻素己能減輕大鼠的神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛。而小鼠腹腔注射鉤吻素己的毒性研究顯示，其半數(shù)致死量（LD50）為0.165mg/kg，是目前為止國產(chǎn)鉤吻中毒性最大的生物堿[11]。由于鉤吻是劇毒植物，其治療量和中毒量相近，治療過程中發(fā)生中毒導(dǎo)致呼吸停止的案例已有報(bào)導(dǎo)，因使用不當(dāng)、自殺或者惡意投毒等原因造成鉤吻中毒的事件也時(shí)有發(fā)生[12-14]，且有關(guān)鉤吻素己在生物樣品中檢測的方法學(xué)，動(dòng)物染毒后的動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)組織分布情況以及排泄方面的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究以鉤吻素己為研究對象，采用單次灌胃染毒法建立大鼠急性中毒模型，探討其在大鼠體內(nèi)的毒物動(dòng)力學(xué)、組織分布以及排泄情況，為鉤吻中毒案件中法醫(yī)學(xué)鑒定的取材及毒理學(xué)研究的開展提供參考和依據(jù)。

圖1 鉤吻素己的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API 4000Q trap四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；HR2860 Cucina攪拌機(jī)（荷蘭皇家飛利浦電子公司）；MD200-2氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛儀器有限公司）；Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；TDZ4-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；BSA 124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

鉤吻素己對照品（純度99.53%）（成都曼思特生物科技有限公司）；士的寧對照品（以97%計(jì)）（中國藥品生物制品檢定所）。

甲醇、乙腈、乙酸銨（純度≥99.0%）、50%甲酸溶液均為HPLC級（美國Fluka公司）；氫氧化鈉（NaOH）、乙酸乙酯均為分析純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為化學(xué)純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

空白血液（經(jīng)肝素抗凝）、空白尿液和空白組織來自未經(jīng)鉤吻素己染毒的大鼠。

1.2 溶液配制

鉤吻素己混懸液：量取超純水150mL置于500mL燒杯中，將稱取的1.0g CMC-Na粉末均勻撒在水面上，密封超聲2 h，待完全溶解后再加入50 mL超純水，繼續(xù)密封超聲0.5 h，即配制成0.5%的CMC-Na溶液，加入適量鉤吻素己對照品配制成一定濃度的鉤吻素己混懸液。

復(fù)溶溶液：V（甲醇）∶V［20mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸和5%乙腈）緩沖溶液］=70∶30。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級SD大鼠56只，雌雄各半，體重230±30 g［（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2012-0002，使用許可證號為SYXK（滬）2012-0002］。本研究所進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合本院倫理委員會的倫理標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 儀器條件

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（150×2.1mm，5μm）（美國安捷倫公司），柱溫為室溫，前接ZORBAX-Extend-C18保護(hù)柱；流動(dòng)相包括A:20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液 （含0.1%甲酸和5%乙腈），B:甲醇，流速為 0.2 mL/min，梯度洗脫程序?yàn)椋?~0.5min10%B，0.5~0.6min10%~40%B，0.6~1.5min 40%B，1.5~1.6 min 40%~70%B，1.6~5.5 min 70%B，5.5~5.6 min 70%~10%B，5.6~8.0 min 10%B；進(jìn)樣量為 5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源-正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），離子源電壓（IS）5500 V，離子源溫度（TEM）500 ℃，氣簾氣（CUR）30 psi，霧化氣（GS1）40 psi，輔助氣（GS2）50 psi。 化合物的兩對母離子/子離子對起定性的作用，第一對離子對用于定量分析。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 鉤吻素己和士的寧的質(zhì)譜參數(shù)

1.4.2 動(dòng)物分組、染毒與取材

通過鉤吻素己單次灌胃染毒法建立大鼠中毒模型，給藥前12 h禁食、自由飲水。試驗(yàn)主要分為3組：毒物動(dòng)力學(xué)組、組織分布組和排泄組。

毒物動(dòng)力學(xué)組：預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，鉤吻素己的毒性作用在大鼠體內(nèi)具有明顯的性別差異，雄性大鼠的耐受性相對更強(qiáng)，因此在毒物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中雌雄大鼠的給藥劑量有所不同。取健康SD大鼠24只，雌雄各半。雌性大鼠隨機(jī)分為低、中、高3個(gè)劑量組，每組4只，鉤吻素己的灌胃劑量分別為0.1、0.2、0.4 mg/kg；雄性大鼠隨機(jī)分為低、中、高 3個(gè)劑量組，每組 4 只，灌胃劑量分別為 0.4、0.8、1.5mg/kg。給藥體積控制在在1~3 mL，于給藥前及給藥后2、5、10、20、30、45、60、120、180、240、360、480 min 從大鼠眼眶靜脈取血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血約300 μL，置于含肝素的抗凝管中，分析檢測前置于-20℃冰箱中保存。

組織分布組：取健康SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組8只，雌雄各半，每只灌胃0.4 mg/kg的鉤吻素己，分別于給藥后5、15、60 min時(shí)處死一組大鼠（4雌4雄），并立即解剖取出心、肺、脾、肝、腎、胰、腦、骨骼肌、胃、小腸、生殖器（雄性：睪丸，雌性：子宮）共11種組織。用剪刀剪開胃和小腸，去除內(nèi)容物并用生理鹽水沖洗干凈，其余組織用生理鹽水快速?zèng)_洗表面，放在濾紙上吸干，然后置于-20℃冰箱中保存。用生理鹽水清洗的目的是去除組織表面的血跡，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

排泄組：取健康SD大鼠8只，雌雄各半，放入代謝籠中收集空白尿液和糞便。然后灌胃給予大鼠0.4 mg/kg的鉤吻素己，置于代謝籠中收集24 h內(nèi)的尿液和糞便，并測量每只大鼠的尿液體積和糞便質(zhì)量。排泄物冷凍保存，待檢。

1.4.3 樣品前處理

取血液或尿液樣品0.5mL，加入2μg/mL士的寧工作液10μL、1%NaOH溶液50μL，渦旋混合1min（混合物pH值約為8.2），再加入乙酸乙酯3 mL萃取，渦旋2 min后，以離心半徑12 cm，3 000 r/min離心3min。取上清液于50℃氮吹儀上吹干，殘留物中加入復(fù)溶溶液100μL，混勻后供LC-MS/MS分析。

將生物組織剪碎并研磨成勻漿，稱取組織勻漿0.5 g，加入 2 μg/mL 士的寧工作液 10 μL、1%NaOH溶液 800 μL，渦旋混合 1 min（混合物 pH≈9），再加入乙酸乙酯3 mL萃取，渦旋3 min后，以離心半徑12 cm，3 000 r/min離心3 min。取上清液置于50℃氮吹儀上吹干，殘留物中加入復(fù)溶溶液200 μL，渦旋均勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于-20℃冰箱中放置30 min，4℃下以離心半徑9.5 cm，13 000 r/min離心2 min，取上清液供LC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS法測定生物檢材中鉤吻素己含量的方法學(xué)確認(rèn)

本研究前期筆者已建立了測定生物檢材（血液、尿液、肝組織）中鉤吻素己含量的LC-MS/MS法，并進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證[15]。結(jié)果表明鉤吻素己在 0.05~30 ng/mL（0.05~30 ng/g）范圍內(nèi)線性良好，檢出限為 0.01 ng/mL（0.01 ng/g），提取回收率為67.55%~114.59%，準(zhǔn)確度在99.00%~114.33%之間，日內(nèi)、日間精密度均不超過7.48%，符合生物樣品定量檢測的要求。

2.2 給藥劑量的選擇

鉤吻素己是國產(chǎn)鉤吻中毒性最大的生物堿，小鼠腹腔注射的LD50為0.165 mg/kg[11]。以此為基礎(chǔ)，本研究通過預(yù)試驗(yàn)考察了單次灌胃 4.0、2.0、1.5、1.0、0.4、0.2、0.1 mg/kg 鉤吻素己后雌雄大鼠的癥狀表現(xiàn)。選擇給藥劑量時(shí)需保證高、中、低三個(gè)劑量組大鼠呈現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，且在整個(gè)采血時(shí)間段內(nèi)未出現(xiàn)死亡。此外，鉤吻素己對大鼠毒性作用有明顯的性別差異，相同給藥劑量下雄性大鼠的中毒癥狀較輕，且致死劑量比雌性高，因此本研究對雌、雄性大鼠的給藥劑量不完全一致。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，雌性大鼠高、中、低劑量分別選擇 0.4、0.2、0.1 mg/kg，雄性大鼠分別選擇 1.5、0.8、0.4mg/kg，以研究鉤吻素己在雌雄大鼠體內(nèi)的毒物動(dòng)力學(xué)差異；灌胃給予相同劑量0.4 mg/kg鉤吻素己，目的是更加直觀地比較鉤吻素己在雌雄大鼠體內(nèi)的組織分布差異和排泄差異。

2.3 鉤吻素己灌胃給藥后大鼠的中毒癥狀

大鼠給予鉤吻素己灌胃給藥后，高、中劑量組大鼠（雄性大鼠給藥劑量分別為1.5、0.8 mg/kg，雌性大鼠給藥劑量分別為0.4、0.2 mg/kg）在染毒后10 min頭部開始發(fā)抖、四肢無力、叩牙，約15 min時(shí)出現(xiàn)頭腹貼地、叩牙頻繁、全身痙攣、呼吸困難等癥狀，約30 min后痙攣癥狀減輕，但四肢仍然無力，45 min左右中毒癥狀基本消失，逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)；低劑量組大鼠（雄性大鼠給藥劑量為0.4 mg/kg，雌性大鼠為0.1 mg/kg）在給藥10 min左右出現(xiàn)少動(dòng)、頭部發(fā)抖癥狀，而后逐漸恢復(fù)正常。同等給藥劑量時(shí)雌性大鼠中毒癥狀更加明顯。

2.4 鉤吻素己灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的毒物動(dòng)力學(xué)

雌性、雄性大鼠經(jīng)鉤吻素己單次灌胃染毒后，各劑量組的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2～3。通過藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件PKSolver2.0，采用非房室模型對鉤吻素己的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，計(jì)算出的主要毒物動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2～3。大鼠灌胃染毒后約10~20min，鉤吻素己血藥濃度達(dá)到峰值。雌性大鼠單次灌胃0.1、0.2 mg/kg鉤吻素己時(shí)，消除半衰期（t1/2）分別為 72.09、89.60 min，說明其在體內(nèi)保留時(shí)間短、代謝速度快，而給藥劑量增大至0.4mg/kg時(shí)，t1/2為 162.60 min，與 0.1、0.2 mg/kg劑量組相比，t1/2明顯延長，且藥時(shí)曲線下面積與給藥劑量不成正比，說明在0.4 mg/kg給藥劑量下，鉤吻素己在雌性大鼠體內(nèi)呈非線性動(dòng)力學(xué)。雄性大鼠也出現(xiàn)了類似的情況，在0.4、0.8 mg/kg鉤吻素己的給藥劑量下呈線性動(dòng)力學(xué)，在1.5 mg/kg給藥劑量下呈非線性動(dòng)力學(xué)。這可能是由于鉤吻素己與血漿/組織蛋白質(zhì)發(fā)生了結(jié)合，或者給藥劑量超過了一定限度，與代謝有關(guān)的酶的催化能力和載體的轉(zhuǎn)運(yùn)能力達(dá)到了飽和，從而引起了非線性動(dòng)力學(xué)過程。

另外，鉤吻素己的代謝在大鼠體內(nèi)具有明顯的性別差異。灌胃給藥相同劑量，即0.4mg/kg鉤吻素己時(shí)，雌性大鼠峰濃度為8.56 ng/mL，藥時(shí)曲線下面積為 931.27（ng/mL）·min，半衰期為 162.60min，清除率為 0.40 L/（kg·min），雄性大鼠峰濃度為2.79ng/mL，藥時(shí)曲線下面積為 180.51（ng/mL）·min，半衰期為77.12 min，清除率為 4.16L/（kg·min），表明鉤吻素己在雌性大鼠體內(nèi)的暴露程度大于雄性，而代謝活性卻相對較弱。

圖2 雌性大鼠單次灌胃0.1、0.2、0.4 mg/kg鉤吻素己平均血藥濃度-時(shí)間曲線

圖3 雄性大鼠單次灌胃0.4、0.8、1.5mg/kg鉤吻素己平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 雌性大鼠單次灌胃0.1、0.2、0.4 mg/kg鉤吻素己的毒物動(dòng)力學(xué)參數(shù) （n=4）

表3 雄性大鼠單次灌胃0.4、0.8、1.5 mg/kg鉤吻素己的毒物動(dòng)力學(xué)參數(shù) （n=4）

2.5 鉤吻素己灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的組織分布

大鼠單次灌胃0.4 mg/kg鉤吻素己，選擇給藥后5、15、60 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，所測得的組織濃度分別代表吸收相、平衡相和消除相的藥物分布，各組織中待測物的濃度見圖4～7。鉤吻素己在大鼠體內(nèi)分布迅速而廣泛，在心、肺、脾、肝、腎、胰、腦、骨骼肌、胃、小腸、生殖器（雄性：睪丸，雌性：子宮）均有不同程度的分布。從組織濃度隨時(shí)間的變化趨勢上來看，小腸、肝、胰在給藥后5 min達(dá)到最大濃度，而后隨時(shí)間的推移開始下降，這可能與灌胃的給藥方式有關(guān)，小腸是主要的吸收器官，巨大的內(nèi)表面積提高了吸收效率，肝和胰是重要的消化器官，肝臟還有代謝的作用，因此給藥后短時(shí)間內(nèi)的組織濃度較高，隨著消化和代謝過程的進(jìn)行濃度下降；而其他組織在給藥后15 min時(shí)濃度最高，60 min時(shí)明顯下降。

從同一取材時(shí)間點(diǎn)不同組織的濃度差異上來看，鉤吻素己在雌性大鼠的小腸、胃、肝、胰中含量較高，其次是腎、肺、脾、子宮，在心、腦、骨骼肌中含量較低，雄性大鼠的組織分布與雌性大體一致，但生殖器官中的含量稍有不同，在小腸、胃、肝、胰中含量較高，其次是腎、肺、脾，在心、腦、骨骼肌、睪丸中含量較低。肝和胰中鉤吻素己的含量僅次于小腸和胃，但高于其他組織，因此在遇到此類中毒案件時(shí)，可優(yōu)先選擇肝和胰作為送檢材料進(jìn)行毒物分析。

從性別差異上來看，給予雌雄大鼠相同灌胃劑量，在相同組織中鉤吻素己的含量不同，給藥后各時(shí)間點(diǎn)雌性大鼠的組織濃度普遍高于雄性，大約是其組織濃度的2～5倍，再次證明鉤吻素己在雌性大鼠體內(nèi)暴露量較大。性別差異可能是由于性激素通過調(diào)節(jié)鉤吻素己相關(guān)代謝酶的水平影響了其代謝過程或細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的代謝過程有差異[16-17]，但具體機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究。

圖4 雌性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

圖5 雌性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

圖6 雄性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

圖7 雄性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

2.6 鉤吻素己灌胃給藥后隨尿液和糞便的排泄情況

大鼠單次灌胃0.4 mg/kg鉤吻素己后，收集24 h內(nèi)的尿液和糞便，檢測待測物的濃度，從而獲得鉤吻素己通過尿液和糞便的排泄情況，結(jié)果見表4～5。雌性大鼠尿液中原藥排泄量占給藥量的（0.179%±0.117%），糞便中原藥排泄量占給藥量的（0.00521%±0.00344%）；雄性大鼠尿液中原藥排泄量占給藥量的（0.0610%±0.0387%），糞便中原藥排泄量占給藥量的（0.00458%±0.00158%）。由此可知，大鼠灌胃給藥后，鉤吻素己通過尿液排泄的比例大于糞便排泄，雌性大鼠的尿液、糞便中原藥排泄比例均大于雄性大鼠，但鉤吻素己通過這兩種途徑的排泄量都非常有限。推測原藥可能通過膽汁、汗液等其他途徑排泄或者藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為代謝物，因而以原型通過尿液和糞便排出的比例較低。

表4 大鼠單次灌胃給藥0.4mg/kg后尿液、糞便中鉤吻素己排泄量

表5 大鼠單次灌胃給藥0.4 mg/kg后尿液、糞便中鉤吻素己排泄量占給藥量百分比

3 結(jié)論

本文通過單次灌胃染毒法建立了鉤吻素己的大鼠急性中毒模型，研究其毒物動(dòng)力學(xué)、組織分布和排泄情況，從而為鉤吻中毒案件中法醫(yī)學(xué)鑒定的取材及毒理學(xué)研究的開展提供了參考和依據(jù)。