阿依提拉·麥麥提江 盧軍 姜林 康小龍 楊曉迷 孟瑤

摘要：目的 觀察刺山柑總生物堿對(duì)系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）小鼠組織纖維化密切相關(guān)的WNT通路中WNT1、WNT2、Dickkopf相關(guān)蛋白2（DKK2）和分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）表達(dá)的影響，探討其對(duì)SSc WNT通路的調(diào)控作用機(jī)制。方法 小鼠皮下注射博萊霉素4周復(fù)制SSc模型。90只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、青霉胺組和刺山柑總生物堿組低、中、高劑量組，受試藥組小鼠背部外敷刺山柑總生物堿乳膏，青霉胺組給予青霉胺灌胃，正常組和模型組小鼠背部外敷不含藥乳膏基質(zhì)，每日1次，連續(xù)8周。HE染色觀察小鼠皮膚組織病理形態(tài)，ELISA檢測(cè)小鼠皮膚組織WNT1、WNT2及血清DKK2、SFRP1的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠皮膚出現(xiàn)明顯炎癥與纖維化的病變，WNT1、WNT2表達(dá)明顯升高，DKK2表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組小鼠皮膚炎癥和纖維化均減輕，WNT1、WNT2表達(dá)明顯降低，DKK2表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），對(duì)SFRP1水平無(wú)明顯影響（P>0.05）。結(jié)論 刺山柑總生物堿可能通過(guò)下調(diào)SSc小鼠WNT1、WNT2表達(dá)和上調(diào)DKK2表達(dá)，對(duì)SSc小鼠WNT通路有一定抑制作用。

關(guān)鍵詞：刺山柑總生物堿；系統(tǒng)性硬皮?。籛NT1；WNT2；Dickkopf相關(guān)蛋白2；分泌型卷曲相關(guān)蛋白1；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0053-04

Abstract： Objective To explore the effects of capparis spinosa total alkaloid on WNT1， WNT2， Dickkopf-related protein 2 （DKK2） and secreted frizzled-related protein 1 （SFRP1） levels； To explore its mechanism of regulation of systemic sclerosis （SSc） WNT pathway. Methods Subcutaneous injection of bleomycin was injected in mice for 4 weeks to replicate the SSc model. Totally 90 BALB/c mice were randomly divided into control group， model group， penicillamine group and capparis spinosa total alkaloid low-， medium- and high-dose groups. Mice in medication groups received external application with capparis spinosa total alkaloid cream； mice in penicillamine group were given penicillamine for gavage； mice in the control and model group received external application without substance， once a day for 8 weeks. The pathological change of skin tissue was observed by HE staining， and the protein expressions of WNT1， WNT2 in skin tissue， and DKK2， SFRP1 in serum were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the inflammation and fibrosis of skin tissue were severe， and the expressions of WNT1 and WNT2 increased and DKK2 decreased markedly in model group （P<0.01）. Compared with the model group， the inflammation and fibrosis of skin tissue were improved， and the expressions of WNT1 and WNT2 decreased and DKK2 increased markedly in capparis spinosa total alkaloid medium- and high-dose groups （P<0.05， P<0.01）. But the level of SFRP1 was not influenced （P>0.05）. Conclusion Capparis spinosa total alkaloid can inhibit the WNT pathway of SSc mice by down-regulating the expressions of WNT1，WNT2 and up-regulating the expression of DKK2 in SSc mice.

Keywords： capparis spinosa total alkaloid； systemic sclerosis； WNT1； WNT2； dickkopf-related protein 2； secreted frizzled-related protein 1； mice

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic sclerosis，SSc）是一種結(jié)締組織疾病，表現(xiàn)為過(guò)量膠原在皮膚、肺、消化道等內(nèi)臟器官沉積，以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為特征[1-2]。本課題組從新疆地產(chǎn)藥材刺山柑Capparis spinosa L.中提取有效成分刺山柑總生物堿用于SSc的治療。前期研究表明，刺山柑總生物堿可明顯降低SSc小鼠真皮厚度，減少皮膚組織羥脯氨酸及Ⅰ、Ⅳ型膠原合成，改善SSc組織纖維化，其作用可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1失衡，減少白細(xì)胞介素-4異常表達(dá)，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-4/干擾素-γ失衡有關(guān)[3-5]。本研究通過(guò)觀察刺山柑總生物堿對(duì)SSc組織纖維化密切相關(guān)的WNT通路中WNT1、WNT2、Dickkopf相關(guān)蛋白2（DKK2）和分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）表達(dá)的影響，探討其對(duì)SSc WNT信號(hào)通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠90只，體質(zhì)量18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2016?0006。飼養(yǎng)于室溫（21±2）℃、相對(duì)濕度35%～55%環(huán)境，光照明暗交替12 h/12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)喂養(yǎng)7 d。

1.2 藥物及制備

刺山柑飲片，新疆麥迪森維藥飲片廠，經(jīng)新疆藥物研究所何江研究員鑒定為正品。刺山柑加10 倍量95%乙醇，80 ℃水浴加熱提取2次，每次30 min，提取物濃縮干燥，得刺山柑總生物堿，總生物堿經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，含量>32%。鹽酸博萊霉素注射劑，海正輝瑞制藥有限公司，批號(hào)17001711；青霉胺片，上海上藥信誼藥廠，批號(hào)052160901。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠WNT1、WNT2、DKK2和SFRP1 ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司。酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

90只BALB/c小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、青霉胺組（125 mg/kg）和刺山柑總生物堿低（225 mg/kg）、中（450 mg/kg）、高（900 mg/kg）劑量組，每組15只。博萊霉素皮下注射法建立SSc模型[6-7]：將小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛剃除，鹽酸博萊霉素粉針劑用生理鹽水配成濃度為300 μg/mL的藥液，除正常組背部皮下注射生理鹽水外，其余各組注射博萊霉素，30 μg/d，注射4周后，刺山柑總生物堿乳膏外敷各受試組小鼠背部，陽(yáng)性藥組予青霉胺灌胃，其余組外用不含藥基質(zhì)，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 切片制作

給藥8周后，取小鼠背部注射區(qū)皮膚，10%福爾馬林固定，HE染色制作切片，觀察病理改變。

2.3 WNT1和WNT2蛋白表達(dá)測(cè)定

給藥8周后，取小鼠背部皮膚，加生理鹽水，組織勻漿機(jī)研磨成勻漿，濃度為10%，4000 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA測(cè)定WNT1和WNT2蛋白表達(dá)，以每毫升上清液中總蛋白含量（二辛可寧酸蛋白定量試劑盒測(cè)定）校正ELISA結(jié)果。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.4 Dickkopf相關(guān)蛋白2和分泌型卷曲相關(guān)蛋白1表達(dá)測(cè)定

給藥8周后，取血，分離血清，采用ELISA試劑盒測(cè)定DKK2和SFRP1表達(dá)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析，組間比較用SNK-q法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 病理變化

模型組較正常組皮膚明顯增厚，膠原纖維增生，毛囊、皮脂腺明顯減少，脂肪層變薄、消失，血管閉塞，真皮下層血管增粗，血管壁明顯變薄，出現(xiàn)不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；刺山柑總生物堿中、高劑量組和青霉胺組較模型組真皮鱗狀上皮變薄，膠原纖維呈均質(zhì)化、排列疏松，數(shù)量明顯減少，皮脂腺增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見圖1。

4.2 刺山柑總生物堿對(duì)模型小鼠皮膚組織WNT1、WNT2表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織WNT1、WNT2表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組WNT1表達(dá)明顯降低，刺山柑總生物堿高、中劑量組WNT2表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01），刺山柑總生物堿各劑量組與青霉胺組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1、表2。

4.3 刺山柑總生物堿對(duì)模型小鼠血清Dickkopf相關(guān)蛋白2表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清DKK2表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，刺山柑總生物堿中劑量組和青霉胺組DKK2表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），刺山柑總生物堿各劑量組與青霉胺組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

4.4 刺山柑總生物堿對(duì)模型小鼠血清分泌型卷曲相關(guān)蛋白1表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清SFRP1表達(dá)升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清SFRP1表達(dá)降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

5 討論

SSc是一種表現(xiàn)為多組織炎癥和纖維化的慢性自身免疫性疾病，目前認(rèn)為SSc病因是由于過(guò)度活化的成纖維細(xì)胞（Fb）合成膠原、纖維連接蛋白和糖胺聚糖等增多，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積，引發(fā)組織纖維化[8-9]。研究顯示，SSc患者Fb增殖及Ⅰ型膠原的合成增加等病理改變可被刺山柑乙醇提取物抑制[10]；硬皮病小鼠真皮增厚、膠原沉積可被刺山柑流浸膏顯著抑制[11]；刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取部位能使增厚的硬皮病小鼠真皮變薄，Ⅰ型膠原及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的過(guò)表達(dá)被抑制[12]。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刺山柑總生物堿可明顯減輕SSc小鼠皮膚纖維化等病理改變。

WNT信號(hào)通路在人體器官發(fā)展和各內(nèi)部組織平衡中起著關(guān)鍵作用。有研究表明，WNT信號(hào)通路在肝、腎、肺、皮膚等器官纖維化進(jìn)程中起到了重要作用，尤其在Fb的增殖及向肌成纖維細(xì)胞（MFb）的分化中起著調(diào)控作用[13]。經(jīng)典的WNT通路包括10個(gè)WNT受體和19個(gè)WNT配體 ，WNT1和WNT2是該通路的起始蛋白，WNT受體與配體的結(jié)合被幾個(gè)WNT抑制劑如DKK、SFRPs所抑制，防止經(jīng)典WNT信號(hào)通路的激活[14-15]。有研究表明，在SSc皮膚和肺組織Fb中經(jīng)典WNT信號(hào)通路被激活，并且發(fā)現(xiàn)WNT1水平升高，DKK2水平降低，導(dǎo)致目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄增加，引起SSc組織纖維化[16-18]。在SSc動(dòng)物模型如博萊霉素誘導(dǎo)的皮膚纖維化和緊皮鼠（Tsk-1鼠），WNT信號(hào)通路被病理性激活并誘導(dǎo)Fb活化和ECM合成增加[13，17]。在體外，重組WNT蛋白可刺激Fb的活化和ECM合成增加[14，16]，WNT2基因在SSc模型小鼠皮損表達(dá)明顯升高，并與纖維蛋白mRNA的高表達(dá)具有一致性，故WNT2過(guò)表達(dá)使Fb轉(zhuǎn)分化為MFb，過(guò)度合成ECM，引起SSc皮膚纖維化[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠皮膚組織WNT1、WNT2表達(dá)明顯升高，血清DKK2表達(dá)降低，與上述研究結(jié)果一致；450、900 mg/kg刺山柑總生物堿可明顯降低WNT1、WNT2表達(dá)，升高DKK2表達(dá)，提示刺山柑總生物堿可能通過(guò)抑制SSc WNT通路的異常激活，增加WNT抑制劑DKK2表達(dá)，抑制WNT受體與配體的結(jié)合，改善SSc組織纖維化。

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