張巳軒，徐芊芊，孫長婷，張 倩，任晶晶，湛孝東，2,李朝品，2

(皖南醫(yī)學院 1.活性生物大分子研究安徽省重點實驗室;2.醫(yī)學寄生蟲學教研室,安徽 蕪湖 241002)

蟬蛹(Cicada pupa)又稱知了猴、蟬猴、蟬龜，多生活在熱帶、亞熱帶和溫帶區(qū)域，屬于節(jié)肢動物門昆蟲綱半翅目蛹科，是蟬不完全變態(tài)發(fā)育(卵、幼蟲、成蟲)過程中的幼蟲階段。蟬蛹是集醫(yī)學價值與營養(yǎng)價值于一身的一種昆蟲資源，蟬蛹含有具有藥理活性的物質(zhì)，可以提高人體免疫力，延緩機體衰老，蟬蛹蛻下的殼富含甲殼素、異黃質(zhì)蝶呤、赤蝶呤、腺苷三磷酸酶，入藥常用于治療外感風熱、咽喉腫痛等癥[1]；蟬蛹含有豐富的蛋白質(zhì)和多種氨基酸[2],是一種高營養(yǎng)價值的食品資源。目前對黃粉蟲[3-4]、蠶蛹[5-6]等昆蟲已有較多的研究，但對于蟬蛹的研究報道并不多見，對蟬蛹蛋白質(zhì)的利用范圍也較局限，易造成資源浪費，因此需要一種較好的蛋白質(zhì)提取方法，將蟬蛹蛋白資源實現(xiàn)最大化利用，為蟬蛹的綜合利用提供方法。本實驗主要用堿提取法、鹽提取法、酶提取法和水提取法提取蟬蛹蛋白，并初步評估各種方式提取蛋白質(zhì)效果的差別。

1 材料與方法

1.1 蟲源 蟬蛹購自皖北農(nóng)貿(mào)市場，清洗并分選新鮮蟲體，摘除頭和足后，剝?nèi)テ?，?jīng)冷凍干燥、磨碎、 40目/吋過篩和石油醚脫脂[7]等，制備成粉末備用。

1.2 試劑與儀器 蒸餾水、磷酸、無水乙醇、石油醚、氫氧化鈉、氯化鈉、尿素等試劑均為分析純，購自無錫展望化工。胰蛋白酶(豬胰)、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250購自Sigma公司。 HH-3數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市億通電子有限公司)，DHG-9070A數(shù)顯不銹鋼鼓風干燥箱(上海索譜儀器有限公司制造)，BS 224S電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，BSXT-02索式提取器(上海比朗儀器制造有限公司)，SIMFD8-3凍干機 (北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，Sigma 3-18KS高速冷凍離心機(北京博勱行儀器有限公司)，XHF-高速勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，U2800紫外分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 堿提取法 取3 g的脫脂蟬蛹粉，在一定的堿濃度(預實驗設置5個濃度梯度)和固液比(預實驗設置5個固液比梯度)的條件下，在一定溫度(預實驗設置5個溫度梯度)下提取一定的時間(預實驗設置5個時間梯度)，將水解液轉(zhuǎn)移到離心管，以4 000 r/min離心20 min，棄沉淀，取上清液，用稀鹽酸將上清液調(diào)至蟬蛹蛋白質(zhì)等電點處(pH=3.5)，再次以4 000 r/min，離心20 min后棄去上清液取沉淀，沉淀放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，即獲得蛋白質(zhì)，測其質(zhì)量。

1.3.2 鹽提取法 取3 g的脫脂蟬蛹粉，在一定濃度的氯化鈉溶液(預實驗設置5個濃度梯度)和固液比(預實驗設置5個固液比梯度)的條件下，在一定溫度(預實驗設置5個溫度梯度)下提取一定的時間(預實驗設置5個時間梯度)，將水解液轉(zhuǎn)移到離心管，在4 000 r/min條件下離心20 min，棄沉淀，取上清液，用稀鹽酸將上清液調(diào)至蟬蛹蛋白質(zhì)等電點處(pH=3.5)，再次以4 000 r/min，離心20 min后棄去上清液取沉淀，將沉淀放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，即可獲得蛋白質(zhì)，稱量質(zhì)量。

1.3.3 酶提取法 稱取3 g的脫脂蟬蛹粉，按照固液比加入一定量的蒸餾水(預實驗設置5組固液比)和胰蛋白酶(預實驗設定5組加酶量w/w)，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0，置于一定溫度下水解(預實驗設置5組溫度梯度)，在水解過程調(diào)pH將其穩(wěn)定在8.0，經(jīng)過一定時間(預實驗設置5組時間梯度)后，升溫至75 ℃滅酶30 min，放于冰箱中靜置12 h，用60目篩過濾蛹粕，經(jīng)冷凍干燥后得到蛋白質(zhì)，放于分析天平測其質(zhì)量。

1.3.4 水提取法 將鮮蟬蛹剝?nèi)し湃霟?，加入適量蒸餾水，在高速分散器內(nèi)切式勻漿機下將蟬蛹磨成勻漿，并加熱到一定溫度(預實驗分設75、80、85、90、95 ℃)，用稀鹽酸調(diào)至pH 3.5左右，靜置12 h后，離心甩干冷凍干燥得粗蛋白質(zhì)。將粗蛋白質(zhì)用索式提取器進行脫脂，得到的蛋白質(zhì)進行質(zhì)量測定。

1.4 考馬斯亮藍法[8-9]測定蛋白質(zhì)含量

1.4.1 標準曲線的繪制 用牛蛋白血清配濃度為1 g/L的蛋白質(zhì)標準液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準蛋白質(zhì)溶液于試管中，每個試管分別補加8 mol/L尿素溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管中并加入5 mL的考馬斯亮藍溶液，搖勻，在595 nm的波長下測定其吸光度，以吸光度為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 樣品蛋白質(zhì)含量的測定 分別取用最優(yōu)條件得到的蛋白質(zhì)樣品，每種樣品蛋白質(zhì)取0.025 g，用50 mL的8 mol/L的尿素[10]溶液進行溶解，取樣0.1 mL，根據(jù)上述步驟測定其吸光度，依據(jù)標準曲線計算出蛋白質(zhì)含量，公式如下：① 蛋白質(zhì)收率=(蛋白質(zhì)產(chǎn)量/取樣質(zhì)量)×100%；② 蛋白質(zhì)提取率=(蛋白質(zhì)產(chǎn)量×蛋白質(zhì)含量)/(取樣質(zhì)量×蟬蛹粉蛋白質(zhì)含量)×100%。

2 結果

2.1 預實驗篩選最優(yōu)條件 本實驗中用控制變量法測出不同條件對蛋白質(zhì)收率的影響，不考慮不同條件之間的相互影響，以蛋白質(zhì)收率高者作為該條件下的最優(yōu)條件。

2.1.1 堿提取法 按照控制變量原則，依據(jù)加堿量、固液比、溫度及時間變化得到蛋白質(zhì)收率最高者分別作為各個變量的最優(yōu)條件，則按照表1堿提取法最優(yōu)條件是堿濃度1.5%，固液比1∶20，溫度60 ℃，提取時間1.5 h。

表1 不同加堿量、固液比、溫度和時間的堿提取法產(chǎn)量和收率

測試條件條件梯度產(chǎn)量/g收率/%加堿量/%0.30.00170.0570.50.00450.151.01.107636.921.51.787759.592.01.657755.26固液比1∶101.293843.131∶121.540151.341∶151.657655.251∶201.913563.781∶251.664155.47溫度/℃501.448848.29601.474949.16701.435047.83801.349544.98901.329644.32時間/h0.51.426647.551.01.585452.851.51.889562.982.01.604753.492.51.302843.43

2.1.2 鹽提取法 按控制變量原則，分別取鹽濃度、固液比、溫度及時間變化得到蛋白質(zhì)收率最高者分別作為各個變量的最優(yōu)條件，則按表2鹽提取法最優(yōu)條件是鹽濃度1.5%，固液比1∶12，溫度50 ℃，提取時間2 h。

表2 不同鹽濃度、固液比、溫度和時間的鹽提取法產(chǎn)量和收率

測試條件條件梯度產(chǎn)量/g收率/%鹽濃度/%0.250.11453.820.50.16965.651.00.27949.311.50.29519.842.00.25428.47固液比1∶80.08822.941∶100.09223.071∶120.09933.311∶150.02860.951∶200.00870.29溫度/℃400.07222.41500.07342.45600.05541.85700.04101.37800.01760.59時間/h10.12724.2420.27949.3130.24108.0340.21297.1050.23477.82

2.1.3 酶提取法 根據(jù)控制變量原則，分別取加酶量、固液比、溫度得到蛋白質(zhì)收率最高者分別作為各個變量的最優(yōu)條件，則按照表3酶提取法最優(yōu)條件是加酶量1.5%，固液比1∶25，溫度40 ℃，由于隨著提取時間的延長，其收率增加不明顯，故選擇提取時間為3 h。

表3 不同加酶量、固液比、溫度和時間的酶提取法產(chǎn)量和收率

測試條件條件梯度產(chǎn)量/g收率/%加酶量/%0.31.604953.500.51.690456.351.01.888562.951.51.973865.792.01.963265.44固液比1∶101.733757.791∶122.080469.351∶151.980266.011∶202.079369.311∶252.148171.60溫度/℃351.880762.69402.151471.71451.988566.28501.943764.79552.01267.07時間/h21.66155.3731.980666.0741.993166.4352.014267.1461.998466.61

2.1.4 水提取法 按照控制變量原則，取溫度作為變化條件得到蛋白質(zhì)收率最高者作為溫度這組變量的最優(yōu)條件，則按照表4水提取法最優(yōu)條件是溫度90 ℃。

表4 不同溫度的水提取法產(chǎn)量和收率

溫度/℃7580859095產(chǎn)量/g2.74722.77402.79242.85472.4419收率/%27.4727.7427.9228.5524.42

2.2 樣品蛋白質(zhì)濃度測量結果 不同樣品溶液吸光度不同，根據(jù)標準曲線計算出每種樣品的蛋白質(zhì)濃度。樣品吸光度測量值、樣品蛋白質(zhì)濃度值如下。堿樣品1：0.200、0.0779 g/L；堿樣品2：0.218、0.0868 g/L；堿樣品3：0.194、0.0750 g/L。鹽樣品1：0.178、0.0671 g/L；鹽樣品2：0.150、0.0533 g/L；鹽樣品3：0.103、0.0301 g/L。酶樣品1：0.094、0.0257 g/L；酶樣品2：0.084、0.0414 g/L；酶樣品3：0.053、0.0055 g/L。水提取法樣品1：0.107、0.0321 g/L；水提法樣品2：0.086、0.0218 g/L；水提法樣品3：0.074、0.0159 g/L。未脫脂樣品：0.179、0.0676 g/L；脫脂后樣品：0.120、0.0385 g/L。

2.3 最優(yōu)條件的實驗結果分析 每種方法以最優(yōu)條件同時進行3組實驗，數(shù)據(jù)見表5。將未脫脂干蟬蛹蛋白質(zhì)含量(13.52%)與脫脂干蟬蛹蛋白質(zhì)含量(7.7%)進行比較，脫脂后的蛋白質(zhì)含量低于沒有進行脫脂的蛋白質(zhì)含量，說明有機溶劑在提取過程中可以造成蛋白質(zhì)含量的丟失，因而高脫脂并且低蛋白質(zhì)含量損耗的有機溶劑有待于進一步探究。

蛋白質(zhì)收率均值進行比較：酶提取法收率最高為73.02%，堿提取法為41.62%，鹽提取法效果最低，僅6.77%，水提取法收率(69.35%)僅次于酶提取法，表明水提取法也可以作為日后提取蟬蛹蛋白質(zhì)的一種新辦法，但需要注意進一步優(yōu)化去除蟬蛹殼、皮等雜質(zhì)的工藝，從而得到更純的蛋白質(zhì)。

不同方法提取蛋白質(zhì)所得蛋白質(zhì)含量也不同，其中堿提取法蛋白質(zhì)含量最高，其平均值為15.98%，其余依次為鹽提取法、水提取法，最低為酶提取法(平均值為3.47%)。根據(jù)蛋白質(zhì)提取率之間的差異得出：堿提取法蛋白質(zhì)提取率最高為86.88%，其余依次為水提取法、酶提取法，鹽提取法蛋白質(zhì)提取率最低(平均值為8.86%)。

將蛋白質(zhì)外觀進行對比，鹽提取法所得蛋白質(zhì)外觀最好，而堿提取法更容易發(fā)生褐變(圖1)。

表5 最優(yōu)條件的實驗結果

蟬蛹質(zhì)量/g蛋白質(zhì)產(chǎn)量/g產(chǎn)量均值/g蛋白質(zhì)含量/%含量均值/%蛋白質(zhì)收率/%收率均值/%蛋白質(zhì)提取率/%提取率均值/%堿提取法31.238715.5841.2985.151.242217.3641.4193.351.26491.2486±0.01151515.98±1.0042.1641.62±0.3982.1486.88±4.74鹽提取法30.195413.426.5111.350.220410.667.3510.170.19390.2032±0.01246.0210.03±3.056.466.77±0.415.058.86±2.73酶提取法32.17835.1472.6148.472.32414.1677.4741.852.06922.1904±0.10441.13.47±1.7268.9773.02±3.489.85333.91±16.87水提取法4.51812.82516.4262.5261.73.34984.3674.1446.143.2253.1333±0.22383.184.65±1.3471.3869.35±4.9632.1246.65±12.08

A.堿提取法蛋白質(zhì);B.鹽提取法蛋白質(zhì);C.酶提取法蛋白質(zhì);D.水提取法蛋白質(zhì)

圖1 不同方法提取的蛋白質(zhì)外觀

3 討論

近些年，人們逐漸重視昆蟲食品的營養(yǎng)價值與醫(yī)學價值，并對蠶蛹、黃粉蟲等昆蟲進行了較多的研究，但蟬蛹的研究報道少見，其作為一種利用價值高的昆蟲資源，需要開發(fā)一種綜合利用的方法。

用干蟬蛹提取蛋白質(zhì)，其中酶提取法收率最高，其次是水提取法、堿提取法，鹽提取法收率最低。在收率方面，用酶法制備蛋白質(zhì)的效果最佳，鹽法制備蛋白質(zhì)的效果最差。本研究將4種方法制備蟬蛹蛋白質(zhì)效果與其他文獻結果進行比較，與仲義等[11]用不同方法提取昆蟲蛋白質(zhì)和潘怡歐[12]的昆蟲蛋白質(zhì)提取工藝比較研究得到類似的結論即胰蛋白酶提取蛋白法最佳，而鹽蛋白法最差。與冀憲領等[13]的黃粉蟲蛋白質(zhì)的提取工藝研究結果鹽法優(yōu)于堿法不同，其原因有待于進一步探究。與周建軍等[5]用簡便方法提取蠶蛹蛋白質(zhì)收率高的研究結果相同。

本研究尚未對各測試條件之間的影響進行實驗，關于蛋白質(zhì)在堿和酶中容易水解為可溶性組分以及一些蛋白為鹽溶組分影響尚未涉及，有待進一步深入研究，對于蟬蛹蛋白的純化及水解物多肽、氨基酸的醫(yī)學價值可作為研究的新思路進行進一步探討。