朱偉東 王富生 王志遠(yuǎn)

摘 要：目的 優(yōu)化實驗條件，建立提取瘢痕膠原蛋白的可靠方法。方法 選擇2015年1月～2016年12月本院20例手術(shù)整形切除增生性瘢痕的標(biāo)本進行研究，用胃蛋白酶的消化方式、用鹽酸溶解法提取瘢痕膠原，用氯化鈉鹽析法制成膠原蛋白膜，用吸收光譜分析、氨基酸成分分析對膠原蛋白進行鑒定。結(jié)果 20例膠原標(biāo)本提取膠原蛋白，通過氨基酸成分分析甘氨酸占30%以上，吸收光譜分析在230 nm處有吸收波峰，證實提取物為來自皮膚瘢痕組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白。結(jié)論 用酶消化、酸溶解、鹽析法提取瘢痕膠原蛋白，方法可靠，操作簡單，提取膠原蛋白純度高，符合Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征，制成膠原蛋白膜為進一步研究瘢痕提供了生物學(xué)模型。

關(guān)鍵詞：增生性瘢痕；膠原蛋白；膠原提??；膠原膜

中圖分類號：R622 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.17.025

文章編號：1006-1959（2018）17-0084-03

Abstract：Objective To optimize experimental conditions and establish a reliable method for extracting scar collagen.Methods From January 2015 to December 2016，20 specimens of surgically resected hypertrophic scars were selected from the hospital.Pepsin digestion method was used to extract scar collagen by hydrochloric acid dissolution method，and collagen was prepared by sodium chloride salting out method.The protein film was identified by absorption spectroscopy and amino acid composition analysis.Results Collagen was extracted from 20 collagen samples， and glycine accounted for more than 30% by amino acid composition.Absorption peaks were observed at 230 nm by absorption spectrum analysis，and the extracts were confirmed to be collagen I and III from skin scar tissue.Conclusion The scar collagen was extracted by enzyme digestion，acid dissolution and salting out.The method was reliable，simple，and the purity of collagen extraction was high，which was consistent with the characteristics of type Ⅰ and Ⅲ collagen.The preparation of collagen membrane provides a biological model for the further study of scar.

Key words：Hypertrophic scar；Collagen；Collagen extraction；Collagen membrane

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中膠原過度增生所致，這個過程并不隨創(chuàng)面修復(fù)而停止，其發(fā)生受全身及局部多種因素影響，從瘢痕組織中提取膠原蛋白，進行相關(guān)生物化學(xué)研究和分子學(xué)研究是進行有關(guān)瘢痕發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的生物學(xué)模型，本課題旨在探索從瘢痕組織中提取純的膠原蛋白，為后期進一步研究提供生物學(xué)模型。我院開展在實驗室條件下提取增生性瘢痕中提取膠原蛋白，并同時探索膠原蛋白成膜技術(shù)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月～2016年12月深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院燒傷整形外科增生性瘢痕組織來自于門診和住院患者20例，所取瘢痕組織為手術(shù)整形切除組織，標(biāo)本取材前向患者說明目的并征得同意。男性 14例，女性6例，年齡8～38歲，平均年齡（22.45±5.65）歲，病程6個月～20年，平均病程（2.47±7.85）年；瘢痕組織來自燒傷瘢痕15例，外傷瘢痕3例，感染瘢痕2例；取材部位：面部 5例，頸部2例，耳2例，前胸3例，會陰1例，四肢7例。

1.2方法 標(biāo)本處理：切去瘢痕組織放置在無菌袋中，4 ℃冰箱保存，術(shù)后修剪切除瘢痕組織，剪除殘留表皮組織，毛囊等皮膚附屬組織，切除皮下脂肪組織備用。用電子天平稱40 g瘢痕組織，用剪刀修成0.1 mm×0.1 mm 微粒組織，放入攪拌機加入蒸餾水100 ml攪拌粉碎5 min，離心機離心4 min，棄去上清液，沉淀物放八錐形燒瓶內(nèi)，加入用10倍體積的40 ml/L鹽酸（pH7.5，0.05 mol/L Tris-HC1配制）混懸后，放置在4 ℃冰箱中24 h，定期搖晃，用鹽酸除去膠原雜質(zhì)。離心機離心：4000 s速離心10 min，分離得到上清液（S1）和沉淀。沉淀用Tris·HCI緩沖液和0.5 mol/L乙酸充分洗滌后，24 h后棄上清液，沉淀用Tris·HCI緩沖液和0.5 mol/L乙酸充分洗滌后，用5倍體積的胃蛋白酶消化液（0.5 mol/L乙酸配成1 g/L）混懸，分成2份。其中1份離心機4000 r/min

速下離心10 min，收集上清液，沉淀加4倍體積的胃蛋白酶消化液重復(fù)酶解1次，離心，取上清液，再攪拌5 min，離心得到上清液為液態(tài)粗制膠原。在粗制膠原中加入氯化鈉使其濃度為1 mol/L，4 ℃鹽析過夜，離心后棄去上清液，沉淀物中加入0.5 M乙酸，即為精制膠原，將精制液態(tài)膠原放入圓盤器皿中，表面加入固體氯化鈉（比例0.1 g/ml），器皿液態(tài)膠原中水分析出，底層沉淀物為形成膠原膜，膠原膜干燥后即瘢痕膠原蛋白膜。

2結(jié)果

采用上述酶消化法及酸溶解法，我們共提取瘢痕膠原20批液態(tài)精制膠原，將所得精制膠原標(biāo)本做氨基酸含量分析及紫外分光吸收檢驗，結(jié)果如下。

2.1氨基酸含量分析結(jié)果 甘氨酸占氨基酸總量的30%以上，符合來源瘢痕皮膚組織膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

2.2紫外分光吸收檢驗結(jié)果 標(biāo)本中的膠原蛋白在230 nm波長下有強烈的光吸收.符合來源皮膚膠原蛋白的特性，見表2。

2.3膠原濃度的測定 應(yīng)用微量凱氏（ Kjedahl）法定氮法對20批膠原進行膠原濃度的測定，結(jié)果為（5.42±1.25）%。

2.4鹽析成膜法 所成的膜測定pH 3～4呈酸性，故我們稱之為酸性膜。用Tris/HC1漂洗后浸泡過液，pH為4～5該膜呈半透明狀，同樣可用平鑷提起。

2.5膠原蛋白模型制備 膠原蛋白成膜后，干燥脫水后即為膠原蛋白模型。

3討論

創(chuàng)面修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞過度增生，膠原蛋白合成酶活性增強，膠原蛋白合成增多，結(jié)果產(chǎn)生大量膠原沉積，是局部瘢痕增生的基礎(chǔ)，尤其是在深度燒傷創(chuàng)面愈合中，膠原蛋白合成和沉積并不隨創(chuàng)面的愈合而停止，最終結(jié)果，深度創(chuàng)面基本愈合時，創(chuàng)面平整，隨后局部瘢痕仍然不停增生，瘢痕增生受許多因素影響，許多研究表面，瘢痕增生過程中，膠原合成速度大于膠原降解，膠原合成酶的活性增強[1]。本課題研究從瘢痕中提取膠原蛋白，并在實驗條件下制成膠原膜，為瘢痕發(fā)生進一步研究，如膠原蛋白合成酶活性，膠原蛋白降解提供了分子生物學(xué)模型。從國內(nèi)外文獻報道中，用酶消化、酸溶解、鹽析法等方法從胎盤，皮膚，軟骨提取純化膠原蛋白報道[2] ，深圳市醫(yī)學(xué)信息中心提供文獻檢索報告中，未見全面針對從增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的膠原實驗室提取和成膜技術(shù)研究的文獻報道。人真皮組織中膠原提取方法有蛋白酶消化法、酸溶解法 、鹽析法提取膠原組織[3]。本課題借鑒上述方法也采用胃蛋白酶消化法、酸溶解法及鹽析法從瘢痕中提取膠原蛋白并制成膠原膜，在膠原蛋白鑒定實驗時，從膠原蛋白中氨基酸含量成分分析，甘氨酸占30%，膠原蛋白光譜分析，波峰230 nm處有吸收高峰，及蛋白電泳結(jié)果證實，提取膠原蛋白符合Ⅰ、Ⅲ型膠原特征，因Ⅰ、Ⅲ型膠原來源于皮膚真皮組織，符合本課題皮膚瘢痕取材來源，Ⅱ型膠原來源于軟骨組織，生物學(xué)特征與上述二者不同[4]膠原的提取方法。主要有酶消化和酸溶解法。酸溶解法可將沒有交聯(lián)的膠原分子溶解提取出來，也可溶解含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原纖維，因為這類交聯(lián)鍵在酸性條件下不穩(wěn)定。但當(dāng)用酸溶解法提取成年動物組織中的膠原時，只能提取出Ⅰ型膠原原。酶消化法則可將膠原分子中兩端非桿狀三螺旋結(jié)構(gòu)里的肽鏈水解， 末端肽亦被切割下來。所以胃蛋白酶消化法提取膠原，酶可消化表皮細(xì)胞，和血管內(nèi)皮細(xì)胞，消化細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)，攪拌和離心后除去膠原以外雜質(zhì)。酸溶解法可使膠原蛋白分解為多肽大分子物質(zhì)，離心后純化，使膠原從粗制變?yōu)榫啤?/p>

膠原成膜，鹽析法可使膠原蛋白脫水，純化膠原蛋白，并制成膜，鹽析法可使膠原從提取后液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)狀，固態(tài)膠原膜干燥后可長時間，常溫下保存，為進一步研究瘢痕提供了一個好的瘢痕生物學(xué)模型，為后期進行相關(guān)瘢痕研究打下良好基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]蔡明達(dá)，胡大海，劉佳琦，等.增生性瘢痕防治的研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2015，12（35）：31-34.

[2]唐云平，鄭強，胡斌，等.重組膠原蛋白制備及其應(yīng)用研究進展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（18）：384-386.

[3]周愛梅，張靜，鄧愛鵬，等.重組人源膠原蛋白的分離純化及其結(jié)構(gòu)表征[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（3）：46-52.

[4]劉志勤，劉浩，馮成寶，等.從牛軟骨中提?、蛐湍z原蛋白及初步構(gòu)建軟骨支架[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2016（3）：386-391.

收稿日期：2018-7-9；修回日期：2018-7-19

編輯/雷華