廖成水，王曉利，杜付玉，郁 川，余祖華，張春杰，李銀聚，吳庭才，劉明遠(yuǎn)，程相朝

旋毛蟲是一種重要的人獸共患胞內(nèi)寄生蟲，寄生于宿主骨骼肌細(xì)胞，目前旋毛蟲具有9個種和3個基因型12個物種[1]。一旦攝入含有旋毛蟲幼蟲的動物肉后，肌肉幼蟲通過消化酶從包囊釋放到胃中，進(jìn)入腸道后發(fā)育為感染性幼蟲[2]。1835年P(guān)age和Owen在實驗中首次分離旋毛蟲[3]，隨后大量研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲幼蟲入侵機(jī)體不是簡單的機(jī)械性滲透的結(jié)果[4-5]，并且認(rèn)為排泄/分泌產(chǎn)物在旋毛蟲發(fā)育、侵襲和寄生過程中起著重要作用[6]。

核酸酶廣泛存在于微生物，主要參與營養(yǎng)代謝、遺傳物質(zhì)的復(fù)制、重組和修復(fù)機(jī)制以及與微生物感染、免疫有關(guān)[7]。旋毛蟲基因組中擁有125種龐大的DNase II家族蛋白，并且一半以上屬于編碼排泄/分泌產(chǎn)物[8]，但DNase II家族蛋白在旋毛蟲的識別和侵入過程中起的關(guān)鍵作用仍未得到很好闡述。Wang等研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲體外感染腸上皮細(xì)胞時可產(chǎn)生5′-nucleotidase蛋白[9]。5′-nucleotidase是一個核苷酸代謝酶，催化核苷5′-二磷酸酯的水解中生成5′-單磷酸核苷[10]。許多寄生蟲可分泌5′-nucleotidase，但目前有關(guān)旋毛蟲5′-nucleotidase基因及蛋白的研究報道較少。為此，本研究對旋毛蟲5′-nucleotidase基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行了原核表達(dá)，為進(jìn)一步5′-nucleotidase在旋毛蟲感染過程中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物、質(zhì)粒、菌株和蟲種 Wistar大鼠(200.0±20.0 g)購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心；中國河南豬旋毛蟲分離株Trichinellaspiralis(genotype T1)，國際標(biāo)準(zhǔn)蟲種編號為ISS534，由本室大鼠傳代保種；pUC18和pET-32a購自寶生物工程(大連)有限公司，由本實驗常規(guī)保存；大腸桿菌DH5α和大腸桿菌Rosetta購自德國Novagen公司，由本實驗常規(guī)凍存。

1.2主要試劑 胰蛋白胨和酵母浸出物購自英國OXOID公司；TaqPCR Master Mix(2x，blue dye)DNA Marker、BamHI、HindIII、RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、T4連接酶和His標(biāo)簽鎳柱親和層析蛋白純化試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Sigma公司。AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank旋毛蟲5′-nucleotidase基因序列(登錄號AY127571.1)，設(shè)計PCR引物：F：5′-GGATCCTTACAGTTAACACTAATTCATAC-3′(下劃線處為BamH I酶切位點)；R：5′-AAGCTTTCAAACGAAGGTGATGCGAT-3′(下劃線處為Hind III酶切位點)[11]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4旋毛蟲5′-nucleotidase基因的克隆與鑒定 常規(guī)方法收集旋毛蟲肌幼蟲蟲體，根據(jù)Trizol試劑盒的方法得到旋毛蟲總RNA。根據(jù)RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒的方法得到cDNA。以旋毛蟲cDNA為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得plancitoxin-1基因，反應(yīng)程序如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 100 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，目的基因連接至克隆載體pUC18，然后轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，PCR和酶切鑒定后進(jìn)行序列測定。

1.5同源性分析 收集20余種不同物種的5′-nucleotidase類似物氨基酸序列，搜集90余種不同血清型的5′-nucleotidase及其類似物氨基酸序列。MEGA7.0用于分析旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白與其他90多個不同血清型的5′-nucleotidase家族蛋白的相似性。

1.6在線網(wǎng)站分析5′-nucleotidase蛋白理化性質(zhì)http://web.expasy.org/protparam/分析蛋白分子量大小、理論等電點和氨基酸組成。http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html和http://biotech.ou.edu/分別用于分析稀有密碼子和重組蛋白的可溶性。http://web.expasy.org/protscale/分析蛋白的親水性與疏水性。

1.7在線網(wǎng)站預(yù)測5′-nucleotidase蛋白結(jié)構(gòu) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi預(yù)測保守區(qū)域。在線軟件TMHMM program、NetNGlyc、SignalP、NetOGlyc和NetPho分別預(yù)測跨膜區(qū)、N-糖基化位點、信號肽、O-糖基化位點和磷酸化位點。https://www.predictprotein.org/#分析二硫鍵數(shù)量。http://tools.immuneepitope.org/bcell/和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/預(yù)測線性B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞結(jié)合位點。https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage= /NPSA/npsa_server.html和https://swissmodel.expasy.org/分析預(yù)測二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.8原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將正確的重組質(zhì)粒pUC18-5′-nucleotidase經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后連接至表達(dá)載體pET-32a構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-5′-nucleotidase，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta。

1.9重組菌的蛋白表達(dá)與純化 終濃度為1 mmol/L的IPTG對大腸桿菌Rosetta(pET-32a-5′-nucleotidase)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用鎳柱親和層析蛋白純化試劑盒純化重組蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié) 果

2.1旋毛蟲5′-nucleotidase基因的克隆與鑒定 PCR結(jié)果顯示擴(kuò)增到了約1 653 bp的條帶(圖1A)，與預(yù)期的5′-nucleotidase大小一致。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒(pUC18-5′-nucleotidase)雙酶切鑒定，結(jié)果顯示出現(xiàn)約2 686 bp的載體條帶和約1 653 bp的目的條帶(圖1B)。測序結(jié)果與GenBank中AY127571.1的5′-nucleotidase基因的同源性為100%。

2.25′-nucleotidase蛋白的同源性分析 5′-nucleotidase的氨基酸序列與其他物種的5′-nucleotidase蛋白及其類似物的同源性比較低，與已報道的斑馬擬麗魚、根瘤菌、刺尾蝎屬、柱頭蟲、赤擬谷盜等5′-nucleotidase蛋白類似物的同源性集中于29.76%～34.44%，與純綠蜱屬具有39.36%的同源性，遺傳進(jìn)化關(guān)系上被分在一個進(jìn)化支(圖2)。整體上看，旋毛蟲5′-nucleotidase與純綠蜱屬親緣關(guān)系較近。但是5′-nucleotidase基因與GenBank中已報道的斑馬擬麗魚、水螅、刺尾蝎屬、柱頭蟲、赤擬谷盜等的核苷酸同源性集中在65%～72%，與果蠅屬的核苷酸同源性為79%。

圖2 旋毛蟲5′-nucleotidase與其他物種5′-nucleotidase蛋白的遺傳進(jìn)化樹分析 Fig.2 Phylogenetic analysis of 5′-nucleotidase from T.spiralis and other previously reported

旋毛蟲5′-nucleotidase的氨基酸序列與旋毛蟲的其他血清型XP-003380309.1和AAM97494.1的同源性分別達(dá)到100%和96%。旋毛蟲5′-nucleotidase基因的核苷酸序列與旋毛蟲的其他血清型XP-003380309.1和AAM97494.1的核苷酸序列的同源性也分別達(dá)到100%和95%。5′-nucleotidase與KRY37020.1、XP-003380308.1、KRY26807.1、KRY26803.1等分在一個進(jìn)化樹大分支上。

2.35′-nucleotidase蛋白理化性質(zhì)的分析 在線軟件分析顯示5′-nucleotidase的氨基酸數(shù)為550，分子式為C2800H4358N742O803S23，理論分子質(zhì)量和等電點(pI)為62 kD和6.13，119個氨基酸殘基，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為63個；正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為56個。非極性氨基酸占44.4%，極性不帶電荷氨基酸占31.3%，極性帶負(fù)電荷氨基酸占11.4%，極性帶正電荷氨基酸占12.9%。其消光系數(shù)(M-1cm-1=280 nm)為77 280，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為33.45(<40)，屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì)，在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞的半衰期是30 h。疏水指數(shù)為93.80。該序列含有56個稀有密碼子，其中有5處連續(xù)出現(xiàn)稀有密碼子，在大腸桿菌中呈可溶性表達(dá)。該蛋白在11位氨基酸分值最高(2.467)，有最強(qiáng)的疏水性；在72位氨基酸分值最低(-2.833)，有最強(qiáng)的親水性。

2.45′-nucleotidase蛋白結(jié)構(gòu)的分析 保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，5′-nucleotidase蛋白的保守結(jié)構(gòu)域在24-304和332-512位氨基酸之間。5′-nucleotidase在N404VT、N461LS和N522FT共有3個N-糖基化位點。在G47和G535共有2個O-糖基化位點。5′-nucleotidase共存在20個磷酸化位點，分別為9個Ser、6個Thr和5個Tyr，潛力值均大于0.5。另外，該蛋白前21個氨基酸為信號肽，有跨膜區(qū)域，是跨膜蛋白。而且該蛋白質(zhì)含有28個B細(xì)胞線性結(jié)合位點和13個T細(xì)胞結(jié)合位點。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中α-螺旋占43.27%(238個)，伸展鏈占22.73%(125個)，β-折疊占7.82%(43個)，無規(guī)則卷曲占26.18%(144個)。5′-nucleotidase沒有二硫鍵(圖3)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，5′-nucleotidase蛋白序列與PDB數(shù)據(jù)庫中5eqv.1.A模板序列相似性為31.19%(圖4)。

圖3 5′-nucleotidase蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Predicted secondary structure of 5′-nucleotidase protein

圖4 5′-nucleotidase三維結(jié)構(gòu)同源模型Fig.4 Three-dimensinal model of 5′-nucleotidase

2.5pET-32a-5′-nucleotidase重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對重組質(zhì)粒pET-32a-5′-nucleotidase進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示出現(xiàn)約6 000 bp的載體條帶和約1 653 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5)。

M: DL5000 DNA Marker; 1: Products from pET-32a-5′-nucleotidase digested with BamHⅠ+HindⅢ圖5 pET-32a-5′-nucleotidase的酶切鑒定Fig.5 Identification of double enzyme for pET-32a-5′-nucleotidase

2.6pET-32a-5′-nucleotidase的誘導(dǎo)表達(dá)分析 SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在約74 kD處出現(xiàn)目的條帶，而且發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在于菌體超聲后的上清中，說明該蛋白是可溶性蛋白，將超聲后的蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后獲得純化的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果顯示可見較純的目的條帶(圖6)。

M: Protein Marker; 1: Rosetta (pET-32a) without IPTG induction; 2: Rosetta (pET-32a) with IPTG induction; 3: Rosetta (pET-32a-5′-nucleotidase) without IPTG induction; 4: Rosetta (pET-32a-5′-nucleotidase) with IPTG induction; 5: Rosetta (pET-32a-5′-nucleotidase) precipitate of bacteria with IPTG induction; 6: Rosetta (pET-32a-5′-nucleotidase) supernatant of bacteria with IPTG induction; 7: Purified protein圖6 蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products

3 討 論

旋毛蟲病臨床診斷方面最大的困擾是其臨床表現(xiàn)無特異性，患者患病期間發(fā)熱、腹瀉等癥狀時有發(fā)生，重癥患者可引發(fā)心肌炎、肺炎及腦炎等[12]。目前，動物屠宰前旋毛蟲的檢測也被認(rèn)為是阻斷人類旋毛蟲感染的有效方法之一，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)嚴(yán)格規(guī)定對進(jìn)出口屠宰動物必須進(jìn)行旋毛蟲病檢驗[13]。旋毛蟲引發(fā)機(jī)體感染后，腸道區(qū)域嗜酸性粒細(xì)胞等大量增加，在病灶區(qū)聚集并表現(xiàn)出浸潤現(xiàn)象，但腸黏膜并未出現(xiàn)炎性反應(yīng)[14]。5′-nucleotidase是一種作用于腺苷(次黃苷)-5′-磷酸的核酸酶，首次在心臟和骨骼的肌肉中發(fā)現(xiàn)，它能催化核糖與脫氧核糖部分的核苷酸分子5′-C端的磷酸鹽酯化水解[15]。Cuttell等對侵入機(jī)體的旋毛蟲的分泌蛋白進(jìn)行了PCR定量檢測，發(fā)現(xiàn)5′-nucleotidase參與分解核苷酸[16]，但是目前對于旋毛蟲5′-nucleotidase基因特征及功能的相關(guān)研究尚未見報道。

本研究利用多種生物信息學(xué)在線軟件對旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測和分析。旋毛蟲5′-nucleotidase基因在同一物種屬內(nèi)差異較小，在不同物種之間的差異性比較大。該蛋白含有28個B細(xì)胞線性結(jié)合位點和13個T細(xì)胞結(jié)合位點。糖基化位點預(yù)測結(jié)果顯示，旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白含有3個N-糖基化位點和2個O-糖基化位點，這些糖基化位點的存在對蛋白質(zhì)的功能的調(diào)節(jié)起著重要的作用。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白含有信號肽，屬于分泌性蛋白。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白的二級結(jié)構(gòu)存在大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，這表明此蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì)。對旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白質(zhì)序列模序進(jìn)行在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白含20個潛在磷酸化修飾位點。旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白磷酸化位點的存在與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和蛋白定位等過程關(guān)系密切，但旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白的磷酸化位點是否與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及蛋白定位等過程有關(guān)目前尚未確切研究。

本研究成功克隆了旋毛蟲5′-nucleotidase基因，并對其序列特征進(jìn)行了分析，同時構(gòu)建了旋毛蟲5′-nucleotidase的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌Rosetta中呈可溶性表達(dá)。為深入探究旋毛蟲5′-nucleotidase蛋白的功能及在旋毛蟲感染宿主中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。