侯建峰，楊亞明，王 莉，王 莉

(1.榆林市第一醫(yī)院 a.肝膽外科；b.體檢中心B超室，陜西榆林 719000；2.寶雞市第二中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，陜西寶雞 721300)

肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)是一種原發(fā)于肝外膽管上皮的惡性腫瘤，是常見的膽道梗阻性疾病之一，手術(shù)切除率低，一般預(yù)后較差[1，2]。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GLDH)主要分布于肝細(xì)胞，正常情況下GLDH表達(dá)水平很低，在肝臟疾病尤其涉及肝細(xì)胞線粒體損害時(shí)其表達(dá)水平及活性顯著升高[3]。目前研究認(rèn)為GLDH在谷胱甘肽生成中起著關(guān)鍵作用，是維持細(xì)胞氧化還原平衡的重要分子，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)[4～6]。本研究觀察160例ECC患者腫瘤組織GLDH表達(dá)情況，比較不同表達(dá)水平患者平均生存時(shí)間，旨在討論ECC患者腫瘤組織GLDH表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集2005年1月～2015年12月于我科手術(shù)切除治療的160例ECC患者納入研究作為病例組，所有患者均在未進(jìn)行化療及放療之前經(jīng)病理切片確診，其中男性110例，女性50例，年齡37～69歲，平均年齡63歲。其中腫瘤表達(dá)CD34+患者60例，CD34-表達(dá)100例；病理分級(jí)，高分化腺癌60例，中分化腺癌52例，低分化腺癌48例；肉眼及病理切片可見血管血栓29例，血管侵犯131例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移109例，包膜及神經(jīng)侵犯55例，無(wú)神經(jīng)侵犯105例。選擇同期膽管正常組織標(biāo)本30例作為對(duì)照，均經(jīng)病例確診無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.2 試劑和儀器 羅氏Bench Mark XT免疫組化染色機(jī)(瑞士Ventana公司)，普通光學(xué)顯微鏡(日本尼康)，相關(guān)試劑及GLDH鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruze公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)GLDH表達(dá)水平：所有標(biāo)本由10 g/dl中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 mm切片，采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測(cè)GLDH表達(dá)情況。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分方法：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞<10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞10%～35%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞35%～70%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>70%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分方法：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色或深黃色為2分，棕色或棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0分為陰性(-)，≥1分為陽(yáng)性，其中1～3分為低表達(dá)(+)，4～7分為中表達(dá)，8～12分為高表達(dá)。

1.3.2 隨訪：所有患者均接受規(guī)范化隨訪，后續(xù)檢查包括腹部超聲，X線胸片，肝功能試驗(yàn)，血清CA199和CEA水平監(jiān)測(cè)。手術(shù)后前兩年每隔2月檢查1次，之后每3個(gè)月檢查1次。術(shù)后每6個(gè)月進(jìn)行對(duì)比增強(qiáng)CT或MRI檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)比分析存活概率。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素及多因素變量分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLDH在ECC患者腫瘤組織中表達(dá)情況 見圖1。

(1.放大200倍；2.放大400倍)A：GLDH低表達(dá)；B：GLDH中表達(dá)；C：GLDH高表達(dá)

GLDH表達(dá)主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，在ECC組織中GLDH染色呈斑片狀或彌漫性分布，正常膽管組織中GLDH染色呈點(diǎn)狀分布。本研究所有ECC組織標(biāo)本及正常膽管組織標(biāo)本未見陰性表達(dá)。160例ECC患者腫瘤組織標(biāo)本GLDH低表達(dá)、中表達(dá)和高表達(dá)分別有45例(28.1%)，57例(35.6%)和58例(36.3%)；30例對(duì)照組膽管組織標(biāo)本GLDH低表達(dá)、中表達(dá)和高表達(dá)分別有22例(73.3%)，7例(23.3%)和1例(3.3%)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.590，P=0.000)。

2.2 GLDH表達(dá)與ECC患者臨床病理特征的相關(guān)性 見表1。腫瘤組織GLDH表達(dá)強(qiáng)度與ECC患者年齡、CD34表達(dá)情況、細(xì)胞分化程度及有無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)均密切相關(guān)(χ2=12.145～158.075，均P<0.05)，與患者性別、有無(wú)包膜侵犯、有無(wú)血管侵犯及有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)明確相關(guān)性(χ2=0.832～2.319，均P>0.05)。

表1GLDH表達(dá)與ECC患者臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.2 GLDH表達(dá)與ECC患者預(yù)后的關(guān)系 見圖2。繪制各主要參數(shù)Kaplan-Meier曲線，腫瘤組織GLDH低表達(dá)、中表達(dá)、高表達(dá)患者的平均生存時(shí)間分別為44.3個(gè)月，26.0個(gè)月和11.6個(gè)月，Log-rank檢驗(yàn)提示3組生存曲線差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.367，P=0.001)。另外，患者發(fā)病年齡、CD34表達(dá)、細(xì)胞分化程度、包膜侵犯及神經(jīng)浸潤(rùn)等參數(shù)也同患者生存時(shí)間密切相關(guān)(χ2=12.684～38.670，均P<0.05)。進(jìn)一步采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)單因素分析P<0.05的參數(shù)進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤組織GLDH高表達(dá)、CD34陽(yáng)性、神經(jīng)浸潤(rùn)和細(xì)胞分化程度低均是ECC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.022～11.647，均P<0.05)，見表2。

表2 多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果

3 討論

越來(lái)越多研究證據(jù)表明，GLDH作為谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，GLDH可將谷氨酰胺分解生成ATP，支持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)合成谷胱甘肽減輕腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[4～7]。還有研究發(fā)現(xiàn)多種致癌基因和腫瘤抑制劑，包括p53，人去乙?；?，雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1等也通過(guò)參與谷氨酰胺代謝調(diào)控過(guò)程發(fā)揮作用[8～10]。

圖2 各參數(shù)Kaplan- Meier曲線

目前，GLDH已成為癌癥治療研究的熱門作用靶點(diǎn)，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，GLDH抑制劑可通過(guò)降低GLDH活性，抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤的生長(zhǎng)[11，12]。近年來(lái)，相繼有研究證實(shí)GLDH參與肝癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌等多種腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過(guò)程[13，14]。因此，鑒于GLDH在肝膽組織中分布及活性遠(yuǎn)高于機(jī)體其他器官，筆者認(rèn)為有理由推測(cè)ECC患者腫瘤組織GLDH表達(dá)與疾病進(jìn)展相關(guān)。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)160例ECC腫瘤組織及30例膽管正常組織GLDH表達(dá)情況，研究顯示，與正常膽管組織相比，GLDH在ECC組織中呈明顯高表達(dá)趨勢(shì)。腫瘤組織GLDH表達(dá)強(qiáng)度與ECC患者年齡、CD34表達(dá)情況、細(xì)胞分化程度及有無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)均密切相關(guān)，而與患者性別、有無(wú)包膜侵犯、有無(wú)血管侵犯及有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)明確相關(guān)性。同時(shí)，本研究分析比較腫瘤組織GLDH不同表達(dá)水平患者術(shù)后預(yù)后情況，結(jié)果顯示GLDH低表達(dá)、中表達(dá)、高表達(dá)患者生存曲線差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GLDH高表達(dá)患者平均生存時(shí)間顯著降低。進(jìn)一步Cox多因素分析結(jié)果顯示腫瘤組織GLDH高表達(dá)是ECC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，ECC患者腫瘤組織GLDH表達(dá)顯著增高，可能是ECC手術(shù)患者的一個(gè)重要預(yù)后指標(biāo)。GLDH有望成為ECC治療的新靶點(diǎn)，期待更多研究進(jìn)一步證實(shí)。