譚玉華，朱應(yīng)竹，江 燚，陶佳俊，吳能偉

(廣州市豐華生物工程有限公司體外診斷試劑研發(fā)中心，廣州 510730)

全球結(jié)核病2016年度報(bào)告發(fā)布，近年全球結(jié)核病患者數(shù)量仍呈上升趨勢，我國結(jié)核發(fā)病人數(shù)再居全球第三位，全球結(jié)核病疫情仍然處于較高狀態(tài)，控制形勢依然嚴(yán)峻[1]。結(jié)核病依然是十大致死原因之一，肺結(jié)核發(fā)病率和死亡率均居第二位[2]。世界衛(wèi)生組織也再次強(qiáng)調(diào)了“終止結(jié)核病策略”，但近年全球結(jié)核病的發(fā)病率僅以每年2%的緩慢速度下降。結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberclebacilosis，TB)感染的診斷一直是臨床上的一個(gè)難點(diǎn)，因此急需新的、革命性的技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核病防控。γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assays，IGRAs)作為結(jié)核感染篩查最新方法，已在歐美國家得到全面推廣，并寫入了診療指南，推薦替代結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)作為結(jié)核感染檢測的實(shí)驗(yàn)室檢測方法[3]。時(shí)間分辨免疫熒光法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是用三價(jià)稀土離子及其鰲合物為示蹤劑的超靈敏度檢測技術(shù)，已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量檢驗(yàn)中最有發(fā)展前景的分析手段之一。筆者基于IGRAs和TRFIA原理，建立了一種TRFIA檢測結(jié)核感染T細(xì)胞釋放γ-干擾素(interferon gamma，IFN-γ)的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 用肝素鈉抗凝管采集了297例患者的全血樣本，其中175例為已按中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]確診的結(jié)核病患者，包括73例結(jié)核分枝桿菌陽性肺結(jié)核患者，77例結(jié)核分枝桿菌陰性肺結(jié)核患者和25例肺外結(jié)核患者；另52例為呼吸道疾病以外的非結(jié)核患者組，70例為非結(jié)核呼吸道疾病(含肺癌)患者。

1.2 試劑和儀器 鏈霉親和素購于菲鵬股份有限公司；捕獲IFN-γ單克隆抗體和生物素標(biāo)記IFN-γ單克隆抗體購于荷蘭MabTech公司；早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target 6，ESAT6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)購于廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司；牛血清清蛋白購于天津康源生物技術(shù)有限公司，植物血凝素L和重組IFN-γ抗原購于美國Sigma公司；N1-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉購于美國PerkinElmer公司；截留分子量為10 000的超濾離心管購于美國Millipore公司；2.0 ml無內(nèi)毒素離心管購于美國Thermo Fisher公司；肝素鈉抗凝管購于廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司；96孔微孔板購于深圳市金燦華實(shí)業(yè)有限公司；編號(hào)87/586的IFN-γ生物參考標(biāo)準(zhǔn)品購于英國國家生物制品檢定所；丙烯葡聚糖凝膠SephacryTMS-200購于通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展(上海)有限公司；增強(qiáng)液、濃縮洗液和實(shí)驗(yàn)緩沖液由廣州市豐華生物工程有限公司提供；其他試劑為國產(chǎn)分析純；結(jié)核感染T細(xì)胞檢測試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)購于北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。DHP-9052型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，TDL-500C低速離心機(jī)(山東百歐醫(yī)療科技有限公司)，DEM-Ⅲ型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板和AutoTRFIA自動(dòng)熒光免疫分析儀(廣州市豐華生物工程有限公司)，RT-2100C型酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 校準(zhǔn)品的制備：以IFN-γ國際生物參考標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，將重組IFN-γ抗原用50 mmol/L，pH 7.80 Tris-HCl溶液(含50.0 g/L 牛血清清蛋白和0.5 g/L疊氮鈉)配制成A～F的6個(gè)校準(zhǔn)品溶液，其濃度分別為0，10，40，200，1 000，5 000 pg/ml。單位換算為1 IU/ml≈50 pg/ml。

1.3.2 固相抗體包被板的制備：將捕獲IFN-γ單克隆抗體用10 mmol/L，pH 4.5磷酸鹽緩沖液稀釋至最適工作濃度作為包被液。將濃縮洗液用純化水稀釋25倍后作為洗滌工作液。含有10.0 g/L牛血清清蛋白的50 mmol/L，pH 7.8磷酸鹽緩沖液作為封閉液。在96孔微孔板各孔中加入150 μl包被液，2～8 ℃過夜孵育22±2 h，棄去包被液。用洗滌工作液洗滌1次，然后每孔加入250 μl封閉液，37±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3 h，棄去封閉液，真空抽干過塑冷藏。

1.3.3 銪標(biāo)記物的制備：將1 mg的鏈霉親和素加入截留分子量為10 000的超濾離心管中，10 000 r/min離心9～10 min。再用50 mmol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液重復(fù)離心洗滌3～5次。將處理好的1 mg鏈霉親和素加入含有1 mg N-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉凍干粉小瓶中，2～8 ℃避光緩慢振蕩孵育72±2 h，標(biāo)記反應(yīng)液用50 mmol/L，pH 7.8 Tris-HCl緩沖液平衡的SephacryTMS-200柱(0.5 cm×30 cm)層析，A280nm監(jiān)測收集第一洗脫峰。

1.3.4 生物素標(biāo)記抗體的制備：將生物素標(biāo)記IFN-γ單克隆抗體用50 mmol/L，pH 7.80 Tris-HCl溶液(含50.0 g/L 牛血清清蛋白和0.5 g/L疊氮鈉)稀釋成工作濃度。

1.3.5 培養(yǎng)管的制備：配制含有50 g/L 牛血清清蛋白的50 mmol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖液作為刺激物稀釋液。在無內(nèi)毒素離心管中直接加入10 μl刺激物稀釋液，作為空白對(duì)照管N。將ESAT6和CFP-10在同一容器中分別用刺激物稀釋液稀釋成3 mg/L，然后取10 μl加入無內(nèi)毒素離心管中，作為測試管T。將植物血凝素L用刺激物稀釋液稀釋成5 mg/L，然后取10 μl加入無內(nèi)毒素離心管中，作為陽性對(duì)照管P。

1.3.6 IFN-γ體外釋放：按空白對(duì)照管N，測試管T和陽性對(duì)照管P的順序，在3種培養(yǎng)管中分別加入1 ml全血樣本(肝素鈉抗凝)，立刻顛倒混勻6次以上，使內(nèi)容物與血液充分混勻。將以上加有全血的3種培養(yǎng)管放入恒溫培養(yǎng)箱(37±1 ℃)中培養(yǎng)16～24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)管以3 000～5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取各培養(yǎng)管中的血漿以待檢測IFN-γ濃度。

1.3.7 IFN-γ定量檢測：將濃縮洗液用純化水在干凈的容器中按體積比1∶25倍稀釋，作為洗滌工作液加入洗板機(jī)中備用。吸取100 μl的校準(zhǔn)品或待測樣本依次加入固相抗體包被板的微孔中，在室溫下緩慢振蕩孵育45 min。用洗板機(jī)洗滌5次，拍干。再向每孔中加入100 μl生物素標(biāo)記抗體工作液，在室溫下緩慢振蕩孵育45 min。用洗板機(jī)洗滌5次，拍干。向每孔中加入100 μl標(biāo)記物工作液，在室溫下緩慢振蕩孵育15 min。用洗板機(jī)洗滌6次，拍干。向每孔中加入增強(qiáng)液100 μl，于室溫下緩慢振蕩5 min后在TRFIA儀上檢測熒光計(jì)數(shù)值(counts per second，CPs)，30 min內(nèi)完成檢測，并用配套的軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.8 參比方法操作：結(jié)核感染T細(xì)胞檢測試劑盒 (體外釋放酶聯(lián)免疫法)作為參比試劑。嚴(yán)格按試劑和儀器說明書操作檢測。

1.3.9 判斷標(biāo)準(zhǔn)：檢測樣本時(shí)，自建TRFIA和體外釋放酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)均按SN/T 3312-2012行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[5]中的結(jié)果判定與報(bào)告方法，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.3.10 方法評(píng)價(jià)：按參考文獻(xiàn)[6，7]方法對(duì)自建TRFIA的劑量-反應(yīng)曲線、精密度、檢測低限、生物檢測限、功能靈敏度、線性、準(zhǔn)確度、特異度等進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與ELISA進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 抗體和標(biāo)記物使用濃度或稀釋度 經(jīng)方陣(棋盤)滴定法，當(dāng)捕獲抗體濃度為5.0 μg/ml，生物素標(biāo)記抗體工作稀釋度為1∶1 800和銪標(biāo)記物工作稀釋度為1∶500時(shí)，本底良好(<1 300 CPs)，校準(zhǔn)品B～F的CPs分別與校準(zhǔn)品A的CPs比值均趨于最大，因此捕獲抗體使用濃度為5.0 μg/ml，生物素標(biāo)記抗體使用工作稀釋度為1∶1 800和銪標(biāo)記物使用工作稀釋度為1∶500。

2.2 劑量-反應(yīng)曲線 見圖1。自建TRFIA采用雙對(duì)數(shù)(Log_LogB)數(shù)學(xué)模型及三次樣條插值(spline)擬合分析，劑量-反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient，r)可達(dá)0.990 0以上。

圖1 TRFIA檢測IFN-γ的劑量-反應(yīng)曲線

2.3 精密度 自建TRFIA實(shí)驗(yàn)內(nèi)測定16，112，325 pg/ml的IFN-γ國際生物參考標(biāo)準(zhǔn)品各20次，其結(jié)果分別為16.64±0.74，118.12±2.97和337.14±12.19 pg/ml，實(shí)驗(yàn)內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)分別為4.45%，2.51%和3.62%。實(shí)驗(yàn)間測定20次，其結(jié)果分別為16.60±0.95，110.28±4.86和307.50±26.49 pg/ml，其實(shí)驗(yàn)間CV分別為5.72%，4.41%和8.61%。

2.5 生物檢測限 檢測限樣品0.45，0.90，1.80，3.60和7.20 pg/ml，采用自建TRFIA天間檢測20次，在0.90 pg/ml IFN-γ組99.7%的可能性出現(xiàn)的最低熒光值為(1 365-3×296)CPs，即477 CPs，已大于空白熒光值平均值可能有的最高值(132×3)CPs，即396 Cps，說明0.90 pg/ml的樣品CPs值有99.7%的可能性，一定大于空白的CPs值，能定量地報(bào)告結(jié)果。0.90 pg/ml為自建TRFIA檢測IFN-γ的生物檢測限。

2.6 功能靈敏度 檢測限樣品0.45，0.90，1.80，3.60和7.20 pg/ml，采用自建TRFIA天間檢測20次，在1.80 pg/ml IFN-γ組的熒光值為1 744±318 CPs，天間CV為18.23%，小于并接近20%。因此，自建TRFIA檢測IFN-γ的功能靈敏度為1.80 pg/ml。

2.7 線性 自建TRFIA檢測2，10，40，200，1 000和5 000 pg/ml的IFN-γ線性評(píng)價(jià)樣品，實(shí)測濃度與理論濃度的線性回歸方程為Y=0.9 938X+1.3 166，r=1。

2.8 準(zhǔn)確度 自建TRFIA檢測濃度為2，10，40，200，1 000和5 000 pg/ml的IFN-γ國際生物參考標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)測值與標(biāo)示值的相對(duì)偏倚在-1.79%～4.60%內(nèi)。

2.9 干擾試驗(yàn) 自建TRFIA檢測添加以下干擾物的血漿樣本與添加等體積生理鹽水的對(duì)照樣本，結(jié)果間偏倚在±10%范圍內(nèi)。干擾物質(zhì)：腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-18，IL-21，IL-32，IFN-ω，IFN-α，膽紅素，血紅蛋白和三酰甘油，干擾限濃度分別達(dá)116 pg/ml，790 pg/ml，62 pg/ml，44 pg/ml，1 034 pg/ml，2 192 pg/ml，13 pg/ml，476 pg/ml，442 pg/ml，2 050 pg/ml，280 pg/ml，56.6 pg/ml，500 pg/ml，3 600 pg/ml，818 μmol/L，180 g/L和21.54 mmol/L。

2.10 方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn) 檢測297例臨床樣本，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，自建TRFIA在結(jié)核病組的靈敏度可達(dá)85.71%，在非結(jié)核病組人群中的特異度可達(dá)84.43%，一致率可達(dá)85.19%。自建TRFIA與ELISA檢測臨床樣本陽性符合率達(dá)100%，陰性符合率達(dá)99.22%，總符合率為99.66%，κ為0.9 931，具有高度一致(κ>0.75)。自建TRFIA與ELISA的陽性檢出率結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0，P>0.05)。1例自建TRFIA檢測陽性而ELISA檢測陰性的標(biāo)本為住院結(jié)核分枝桿菌陰性肺結(jié)核組患者樣本。見表1。

表1 TRFIA與ELISA的檢測結(jié)果比較

注：臨床診斷分組中，TRFIA與ELISA的陽性檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臨床診斷分組間，TRFIA的陽性檢出率：a與b，a與c，b與c，d與e間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.725，1.034，0.003，0.308，均P>0.05)；a與d，a與e，b與d，b與e，c與d，c與e之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=74.015，77.371，60.856，63.912，32.828和32.582，P<0.05)；ELISA的陽性檢出率：a與b，a與c，b與c，d與e之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.298，1.034，0.009和0.308，均P>0.05)；a與d，a與e，b與d，b與e，c與d，c與e間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=74.015，77.371，58.438，61.375，32.828和32.582，均P<0.05)。

3 討論

目前診斷結(jié)核病的常見方法有鏡檢法、菌培養(yǎng)法、結(jié)核菌素試驗(yàn)、血清學(xué)檢測方法和影像學(xué)檢查等。鏡檢法的陽性率低，培養(yǎng)法試驗(yàn)周期長，不能滿足臨床的要求[8，9]。結(jié)核菌素試驗(yàn)是目前廣泛應(yīng)用且可以輔助診斷潛伏性結(jié)核菌感染的方法，然而，有些感染者對(duì)結(jié)核菌素是無反應(yīng)的。此外，接種卡介苗，感染非致病性分枝桿菌，以及其他因素，會(huì)導(dǎo)致非結(jié)核分枝桿菌感染者結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性。血清學(xué)檢測方法中的抗體免疫反應(yīng)的延遲性導(dǎo)致早期結(jié)核病診斷結(jié)果易產(chǎn)生假陰性，同時(shí)共同抗原導(dǎo)致的交叉反應(yīng)以及不能區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌都會(huì)導(dǎo)致假陽性患者接受不必要的治療，耽誤了真正治療時(shí)機(jī)[9]，世界衛(wèi)生組織也發(fā)出正式聲明，要求禁止將血清學(xué)檢測方法用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷[10]。影像學(xué)檢查僅對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷具有參考價(jià)值，對(duì)肺外結(jié)核診斷存在困難。因此，尋找一種敏感度高、特異度高、快速、簡便的結(jié)核診斷方法成為人們研究的焦點(diǎn)[8]。

TB-IGRAs是通過結(jié)核分枝桿菌特異抗原所引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，使用ESAT6和CFP-10作為特異性刺激抗原，所有的卡介苗菌株及絕大部分的非結(jié)核分枝桿菌(堪薩斯分枝桿菌，蘇爾加分枝桿菌，海氏分枝桿菌除外)不含有這2種蛋白質(zhì)。感染結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群患者的血液中通常含有能夠識(shí)別這2種蛋白質(zhì)和其它分枝桿菌抗原的淋巴細(xì)胞，這一識(shí)別過程伴隨著IFN-γ的合成和分泌。定量檢測和分析免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生的IFN-γ的濃度，可以判斷受試者是否具有針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。2018年實(shí)施的《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—肺結(jié)核診斷》中在免疫學(xué)檢查中增加了IGRAs[11]，肯定了IGRAs的臨床價(jià)值。

目前市面上的TB-IGRAs試劑盒有兩大類，一種為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法，另一種為體外釋放ELISA。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法作為集細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)為一體的新型檢測技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、操作技術(shù)和質(zhì)量控制要求很高，其實(shí)驗(yàn)體系中的外周血單個(gè)核細(xì)胞分離、加入活體細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞孵育條件、結(jié)果判定等全程質(zhì)量控制，是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵所在[12]。體外釋放ELISA操作相對(duì)簡便，但采用酶作為檢測示蹤物，靈敏度較低，線性范圍較窄。本研究基于TRFIA建立的TB-IGRAs，采用全血培養(yǎng)，無需分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，操作相對(duì)簡便，自動(dòng)化程度高，檢測精密度良好，靈敏度高，優(yōu)于ELISA參比試劑(分析靈敏度為2 pg/ml)；線性范圍寬，上限明顯高于ELISA參比試劑(檢測上限為400 pg/ml)，有利于高值樣本的準(zhǔn)確檢測，準(zhǔn)確度高，特異度強(qiáng)，自建TRFIA檢測臨床樣本與ELISA參比試劑在臨床試驗(yàn)中具有等效性，自建TRFIA可以滿足臨床需要。