朱媛媛，顧萬(wàn)建，徐 天，邵 永，王 成，張春妮

(1.江蘇省中醫(yī)院a.科技處；b.檢驗(yàn)科，南京 210029；2.南京總醫(yī)院a.生殖醫(yī)學(xué)中心；b.檢驗(yàn)科，南京 210002)

不育癥影響了世界范圍內(nèi)大約15%的育齡夫婦，其中男性因素導(dǎo)致不育約占一半[1]?，F(xiàn)有男性不育的診斷方法主要有精液常規(guī)檢查、內(nèi)分泌和基因分析、睪丸活檢或穿刺，但對(duì)于準(zhǔn)確區(qū)分不育男性價(jià)值仍然有限[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類在人和哺乳動(dòng)物中進(jìn)化高度保守的小分子非編碼RNA，可通過(guò)與靶基因信使RNA3’端非翻譯序列完全或不完全堿基配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因蛋白表達(dá)。研究顯示，miRNA廣泛參與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生等生理過(guò)程，其表達(dá)異常與男性不育密切相關(guān)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物和人精漿中也含有豐富、穩(wěn)定表達(dá)miRNA，且男性不育患者精漿miRNA表達(dá)譜與正常生育男性存在明顯差異，一些精漿miRNA在患者中呈現(xiàn)出顯著、穩(wěn)定的變化，具備作為男性不育新型生物標(biāo)志物潛能[4]。miR-551b是人第3號(hào)染色體編碼的一種與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的miRNA，在多種腫瘤中都具有重要的調(diào)控作用[5，6]。最新研究顯示，miR-551b基因單核苷酸多態(tài)性和精子運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)[7]，提示其可能參與了雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育及精子活力調(diào)節(jié)，但其在不育男性精漿中表達(dá)變化趨勢(shì)及與男性不育關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)測(cè)定男性不育癥患者精漿miR-551b水平，探討其水平變化與男性不育的關(guān)系及作為男性不育新型輔助分子標(biāo)志物的潛能。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2008年11月～2015年3月在江蘇省中醫(yī)院男科門診和南京總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的男性不育癥患者92例，其中非梗阻性無(wú)精癥患者46例，弱精癥患者46例，年齡19～41歲，平均年齡29.12±4.46歲，入組標(biāo)準(zhǔn)為：夫妻性生活正常且未行避孕措施2年以上而未能生育者；排除標(biāo)準(zhǔn)為：患精索靜脈曲張、感染、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他慢性疾病。同期招募已育有1個(gè)及以上小孩的正常生育男性34例，年齡22～47歲，平均年齡30±4.89歲，精液參數(shù)均在正常范圍內(nèi)?；颊呒皩?duì)照在樣本采集期間均未服用過(guò)任何藥物。采集精液前禁欲3～7天，洗凈雙手，利用自慰法收集精液于干燥消毒的無(wú)菌容器中，置37℃恒溫箱中溫育30 min，液化后先1 500 r/min離心10 min，再以12 000 r/min離心5 min，取上清(精漿)凍存于-80℃待用。

1.2 主要試劑及儀器 水飽和酚(pH=4.3，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，去RNA酶的DEPC水(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，分析純級(jí)別氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司)，dNTP、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、5×AMV buffer緩沖液、10× PCR buffer緩沖液、25 mmol/L MgCl2、耐熱的rTaq DNA聚合酶(均購(gòu)自TaKaRa公司)；has-miR-551b逆轉(zhuǎn)錄引物、qRT-PCR引物及探針組合試劑盒(美國(guó)ABI公司)；人工合成hsa-miR-551b成熟體(上海Invitrogen公司)；2720型普通PCR儀、7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；常溫低速離心機(jī)(B320A型，河北白洋離心機(jī)廠)；5418型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA，WLJY-9000精子分析儀，北京偉力公司)；BS60型恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；SAS67120型超純水機(jī)(Millipore)公司；Vortex-Genie2渦旋混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精漿RNA提?。喊凑n題組前期建立的方法[8]，采用酸性水飽和酚-氯仿法進(jìn)行抽提精漿總RNA，所得RNA沉淀經(jīng)75 ml/dl無(wú)水乙醇洗滌、晾干后溶于20 μl DEPC水并保存于-80℃用于后續(xù)miRNA測(cè)定。

1.3.2 miR-551b逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR：①cDNA的合成：精漿miR-551b逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)總體系為10 μl，包括10 mmol/L dNTP 1.0 μl，去RNA酶DEPC H2O 3.5 μl，5×AMV酶緩沖液2.0 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，RNA樣品2.0 μl，miR-551b逆轉(zhuǎn)錄引物1.0 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件及程序參數(shù)為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4 ℃保存，每個(gè)反應(yīng)均為1個(gè)循環(huán)。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-551b水平：qRT-PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.0 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl、耐熱的Taq DNA聚合酶0.3 μl，cDNA 1.0 μl，miR-551上、下游引物及TaqMan探針0.33 μl，最后加ddH2O補(bǔ)足總反應(yīng)體積為20 μl。qRT-PCR反應(yīng)條件及程序參數(shù)為：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。精漿miR-551b表達(dá)量的計(jì)算按課題組前期建立方法[8]，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本的Ct值計(jì)算。每個(gè)樣本miR-551b檢測(cè)過(guò)程中設(shè)三復(fù)孔，同時(shí)以DEPC H2O陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad 6.0軟件。精漿miR-551b含量以中位數(shù)(四分位數(shù))[M (P25，P75)]表示，并采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析、比較三組間精漿miR-551b水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。運(yùn)用ROC曲線分析miR-551b對(duì)男性不育患者的輔助診斷價(jià)值。采用Spearman秩相關(guān)性分析精漿miR-551b與其他指標(biāo)間相關(guān)性。精漿miR-551b與男性不育癥的關(guān)系采用邏輯回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精液參數(shù)及精漿常規(guī)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 與正常生育組相比，弱精癥患者精子密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，精子活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；無(wú)精癥患者精子密度和活力均為零。弱精癥、無(wú)精癥患者精液常規(guī)生化標(biāo)志物除α-糖苷之外，其他指標(biāo)如酸性磷酸酶、肉毒堿、果糖水平與對(duì)照相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 精漿miR-551b水平檢測(cè) 與正常生育組[20.63 (9.59，37.83)fmol/L]相比，弱精癥患者精漿中miR-551b含量[62.29(25.22，101.43)fmol/L]顯著增加(U=297，P<0.001)，無(wú)精癥患者精漿中miR-551b含量[4.70(2.41，13.71)fmol/L]顯著降低(U=356，P<0.001)，無(wú)精癥患者精漿miR-551b含量較弱精癥患者亦明顯降低(U=144，P<0.001)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 ROC曲線分析 運(yùn)用ROC曲線分析精漿miR-551b水平對(duì)于男性不育患者區(qū)分的臨床價(jià)值，結(jié)果見(jiàn)圖1。精漿miR-551b區(qū)分弱精癥患者與正常對(duì)照組的AUC ROC為0.810(95%CI 0.718～0.902)，最佳診斷截點(diǎn)為49.44 fmol/L，其特異度和敏感度分別為91.2%和65.2%；區(qū)分無(wú)精癥患者與正常對(duì)照組的AUC ROC為0.772(95%CI 0.667～0.878)，最佳診斷截點(diǎn)為8.09 fmol/L，其特異度和敏感度分別為82.4%和73.9%；鑒別弱精癥患者和無(wú)精癥患者的AUC ROC為0.932(95%CI 0.885～0.979)，最佳診斷截點(diǎn)為9.02 fmol/L，其特異度和敏感度分別為73.9%和100%。

2.4 男性不育癥患者精漿miR-551b與其他指標(biāo)的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果顯示，全部不育癥患者精漿miR-551b水平與精子密度(r=0.735)、精子活率(r=0.643)、a級(jí)精子比例(r=0.672)、a+b級(jí)精子比例(r=0.682)及α-糖苷(r=0.375)呈顯著正相關(guān)(均P< 0.05)，而與酸性磷酸酶(r=-0.078)，肉毒堿(r=0.067)及果糖(r=-0.25)均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。進(jìn)一步的逐步多元線性回歸分析顯示，在校正其他相關(guān)因素的影響下，不育癥患者精漿miR-551b水平則與精子密度呈顯著獨(dú)立相關(guān)(β=0.618，P< 0.001，校正r2= 0.368)。

2.5 邏輯回歸分析 運(yùn)用邏輯回歸分析精漿miR-551b與男性不育癥的關(guān)系及其臨床價(jià)值結(jié)果顯示，當(dāng)以正常生育對(duì)照為二分類參考變量時(shí)，miR-551b是弱精癥患者[OR=24.889(95%CI 5.302 ～ 116.843)，P<0.001]和無(wú)精癥患者[OR=6.303(95%CI 1.316 ～ 30.179)，P=0.021]的危險(xiǎn)因素。

3 討論

目前尚缺乏可靠的分子標(biāo)志物用于男性不育的輔助診斷，WHO推薦常規(guī)精液分析(包括精子密度、活力、形態(tài)等)作為男性不育的主要診斷方法，但研究顯示僅有40%～60%的男性不育患者表現(xiàn)出精液參數(shù)異常，且部分患者精液異常并不能排除正常生育的可能性。精液常規(guī)生化標(biāo)志物，如酸性磷酸酶、肉毒堿、果糖和α-糖苷等，其診斷特異度和敏感度都較差。另有研究顯示，精液脫落細(xì)胞檢測(cè)對(duì)無(wú)精子癥具備一定診斷和參考價(jià)值，可部分代替睪丸活檢，但其臨床價(jià)值尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[9]，故睪丸活檢仍是無(wú)精子癥患者診斷和治療的重要手段，但睪丸活檢具有侵入性，因此迫切需要新的非侵入性分子標(biāo)志物用于評(píng)價(jià)男性不育[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在睪丸組織和細(xì)胞中特異高表達(dá)，并在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。睪丸生精功能障礙時(shí)，miRNA的特異變化能夠在精漿中體現(xiàn)，可作為男性不育新的潛在分子標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)男性不育患者和正常生育對(duì)照精漿miR-551b含量顯著不同，相較于正常生育對(duì)照，弱精癥患者精漿miR-551b含量顯著增加，而無(wú)精癥患者精漿miR-551b含量顯著降低，提示精漿miR-551b有潛力成為男性不育癥的診斷指標(biāo)。由于無(wú)精癥患者精子數(shù)目明顯下降，猜測(cè)精漿miR-551b可能來(lái)源于精子細(xì)胞，而弱精癥患者由于精子功能發(fā)生改變導(dǎo)致凋亡增加，因此精子細(xì)胞中miR-551b釋放增多導(dǎo)致精漿中含量增加可能是其精漿miR-551b升高的潛在機(jī)制。ROC曲線結(jié)果分析顯示miR-551b對(duì)弱精癥和無(wú)精癥具有較高的診斷價(jià)值。同時(shí)，對(duì)弱精癥和無(wú)精癥鑒別診斷的敏感度達(dá)100%，表明精漿miR-551b還有望成為男性不育鑒別診斷的分子標(biāo)志物。相關(guān)性分析顯示，miR-551b和精子密度、活率、前向運(yùn)動(dòng)(a/a+b級(jí))精子比例密切相關(guān)，結(jié)合邏輯回歸的結(jié)果顯示miR-551b是弱精癥和無(wú)精癥的危險(xiǎn)因素，提示miR-551b可能參與了精子發(fā)生和精子運(yùn)動(dòng)。事實(shí)上，F(xiàn)ernandez等[7]報(bào)道m(xù)iR-551b單核苷酸多態(tài)性和公牛精子前向運(yùn)動(dòng)相關(guān)，進(jìn)一步佐證了miR-551b參與了精子活動(dòng)能力的調(diào)節(jié)。另有研究指出，miR-551b可調(diào)節(jié)參與TGF-β通路、細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的靶基因表達(dá)[11]，而TGF-β轉(zhuǎn)錄因子基因家族在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中有重要的調(diào)節(jié)作用[12]，因此推測(cè)miR-551b可能通過(guò)參與TGF-β通路調(diào)節(jié)在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

我們的研究仍存在一定局限性。首先，研究樣本量相對(duì)較少，后續(xù)的研究中應(yīng)需擴(kuò)大樣本量；第二，我們?nèi)孕鑼?duì)miR-551b的靶基因及其在精子發(fā)生和運(yùn)動(dòng)中的功能進(jìn)行研究，以期揭示其在男性不育癥中的參與機(jī)制；另外，精漿miR-551b的具體來(lái)源、存在形式及是否具備一定的生理病理功能目前尚不清楚。最新研究顯示，精漿miRNA可包裹于微囊泡如外泌體(exosome)中，特定細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)分泌exosome并以其為天然生物載體攜帶miRNA進(jìn)入受體細(xì)胞發(fā)揮生理病理功能[13，14]。因此，對(duì)精漿miR-551b的可能來(lái)源、存在形式及可能去向進(jìn)行深入研究可為揭示精漿miRNA生理功能、男性不育發(fā)生潛在分子機(jī)制提供新的方向。

綜上所述，精漿miR-551b在弱精癥患者中含量增加，在無(wú)精癥患者中含量降低，并與精子密度、活率、前向運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，且miR-551b是弱精癥和無(wú)精癥的危險(xiǎn)因素，表明精漿miR-551b有潛力成為新的男性不育診斷和鑒別診斷分子標(biāo)志物，同時(shí)，上述結(jié)果為男性不育的分子機(jī)制研究提供了新的思路和理論依據(jù)。