楊文林，顧慧玲，倪紅燕，王海峰

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院呼吸科，上海 200940)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)作為一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，患病率高，死亡率高，已成為一種公共衛(wèi)生問題。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，若不能及時采取有效措施，在未來20年內(nèi)，包括COPD在內(nèi)的慢性疾病所致疾病負(fù)擔(dān)將超過50%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。COPD的發(fā)病機制尚未完全闡明，且無特殊有效的治療方法。從本質(zhì)上講，COPD是由Th1因子介導(dǎo)，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞等多種炎性介質(zhì)共同參與的氣道、肺血管及肺實質(zhì)慢性炎性反應(yīng)，其發(fā)生與免疫反應(yīng)細(xì)胞及其炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和黏附分子密切相關(guān)[2]。近年來，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎癥小體作為固有免疫系統(tǒng)的一種模式識別受體，與自身免疫疾病和感染性疾病的關(guān)系愈發(fā)引起關(guān)注[3，4]，但關(guān)于其在COPD的發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確。本研究通過建立COPD大鼠模型，分析NLRP3炎癥小體在動物模型肺組織中的表達(dá)水平，探討COPD的發(fā)病機制，為COPD的治療提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar健康雄性大鼠30只，鼠齡12周，體重200±20 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，在清潔的二級動物房中飼養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器 大前門牌香煙(上海卷煙廠)；Trizol(美國Invitrogen公司)；Prime ScritTMRT Reaent Kit；ELISA試劑盒(美國 Blue Gene公司)；ABI 7300 型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組及建立COPD大鼠模型：按隨機數(shù)字表法分為吸煙組(n=20)和正常對照組(n=10)。吸煙組大鼠自實驗第2天起置于自制箱(120 cm×80 cm×80 cm)內(nèi)進(jìn)行被動吸大前門牌香煙(焦油含量23 mg/支上海卷煙廠)，每天3次，第1天8支/次，第2，3天10支/次，第4天后15支/次，每次持續(xù)30 min，3次之間間隔至少3 h，連續(xù)75天。實驗動物操作過程均遵照醫(yī)院動物倫理委員會規(guī)程進(jìn)行。選模后根據(jù)大鼠最大呼氣流速(PEF)及氣道肺組織病理變化分為吸煙COPD組(n=9)和吸煙非COPD組(n=11)。正常對照組大鼠自由飲水和攝食，喂養(yǎng)75天。

1.3.2 檢測指標(biāo)

1.3.2.1 支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集：大鼠采用1 g/dl戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉(33 mg/kg)?？v向剪開頸胸部皮膚和肌肉，暴露出氣管和雙肺。在氣管下部做橫行切口，夾閉右主支氣管，通過硅膠管用注射器從氣管緩緩注入無菌生理鹽水3 ml灌洗左肺，每次注入后立即輕柔回吸得BALF，重復(fù)3 次。灌洗液紗布過濾，回收率為80%～90%。將BALF離心(4℃，2000 r/min，10 min)，細(xì)胞沉淀重新混懸于PBS液并制作4張細(xì)胞涂片，Wright-Giemsa染色做細(xì)胞計數(shù)和分類計數(shù)(至少計數(shù)200個細(xì)胞)，計算巨噬細(xì)胞(AMC)、中性粒細(xì)胞(NEU)和淋巴細(xì)胞(LYM)的絕對計數(shù)。

1.3.2.2 NLRP3炎癥小體濃度的檢測：應(yīng)用人隱熱蛋白NLRP3炎癥小體的檢測試劑盒，嚴(yán)格按說明書用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別測定BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度。

1.3.3 肺組織內(nèi)NLRP3炎癥小體mRNA表達(dá)的檢測：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，依照試劑盒說明書操作。按照Trizol-氯仿抽提法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)MMLV酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，采用NLRP3炎癥小體與β-actin二對引物在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。通過基因庫查找基因序列，引物設(shè)計使用Primer Premier 5軟件。

2 結(jié)果

2.1 各組BALF中細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果比較 見表1。各組BALF中NEU，AMC，LYM計數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與正常對照組比較，吸煙非COPD組、吸煙COPD組BALF中NEU，AMC，LYM計數(shù)明顯升高，與吸煙非COPD組比較，吸煙COPD組BALF中NEU，AMC，LYM計數(shù)亦明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果比較

2.2 各組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度及肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量比較 見表2。各組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與正常對照組比較，吸煙非COPD組、吸煙COPD組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度明顯升高，與吸煙非COPD組比較，吸煙COPD組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度亦明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。吸煙非COPD組和吸煙COPD組肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于正常對照組(P<0.05)。吸煙COPD組肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量顯著高于吸煙非COPD組(P<0.05)。

表2 各組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度及肺組織NLRP3mRNA相對表達(dá)量比較

2.3 NLRP3炎癥小體的表達(dá)與細(xì)胞分類計數(shù)的相關(guān)性 見表3。Spearman秩相關(guān)性分析顯示，BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體濃度、肺組織NLRP3mRNA相對表達(dá)量與NEU，AMC，LYM計數(shù)均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 NLRP3炎癥小體的表達(dá)與細(xì)胞分類計數(shù)的相關(guān)性(r)

3 討論

目前研究認(rèn)為，氣道與肺部的慢性炎癥是導(dǎo)致COPD發(fā)生、發(fā)展的重要機制，但誘發(fā)炎癥產(chǎn)生并大量擴散的機制尚不十分清楚[5]。NLRP3炎癥小體是近年來研究最多的一種炎癥小體，屬于機體固有免疫的一部分，激活后可參與對外來病原體(細(xì)菌、病毒)的抵抗[6，7]。呼吸系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)炎癥小體異常激活導(dǎo)致與疾病相關(guān)的慢性炎癥的發(fā)生，在感染所致病原相關(guān)分子模式的信號刺激、氧化應(yīng)激所致?lián)p傷相關(guān)分子模式的信號刺激下，機體炎性小體信號分子被激活，促進(jìn)配體與NLRP3結(jié)合并形成NLRP3炎性小體，進(jìn)而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，IL-18等大量炎性介質(zhì)釋放[8，9]。Mankan等[10]研究表明，小鼠中性粒細(xì)胞通過活化的NLRP3炎性小體分泌白細(xì)胞介素，其研究中檢測到IL-1β和IL-18分泌增加。因此，學(xué)者推測NLRP3炎性小體可能參與了COPD的發(fā)生、發(fā)展過程，但國內(nèi)外關(guān)于NLRP3炎性小體在COPD的BALF，肺組織等標(biāo)本中表達(dá)水平及臨床意義的研究仍較為少見。

本研究采用單純香煙熏吸法成功建立COPD大鼠模型，BALF中炎癥細(xì)胞計數(shù)與分類對于反映氣道炎癥具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，吸煙非COPD組、吸煙COPD組大鼠BALF中NEU，AMC和LYM計數(shù)明顯高于對照組，且COPD模型較非COPD模型大鼠BALF中NEU，AMC和LYM計數(shù)亦明顯升高(P<0.05)。香煙煙霧導(dǎo)致炎性細(xì)胞聚集于氣道，一方面釋放蛋白酶類和氧自由基，另一方面抑制抗蛋白酶類活性，從而破壞蛋白酶與抗蛋白酶的平衡，不斷加重COPD相關(guān)肺損傷。馮一等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在煙霧刺激下，NEU，AMC和LYM被大量誘導(dǎo)活化，大量蛋白酶類過度釋放，參與了氣道壁及肺泡壁結(jié)構(gòu)的炎癥、破壞及重塑等氣道病理改變，最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生。鐘琳曄等[12]研究認(rèn)為，NLRP3可能對肺泡巨噬細(xì)胞具有刺激作用，促進(jìn)其合成和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)，刺激氣道上皮細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

ELISA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，吸煙非COPD組、吸煙COPD組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度明顯升高，與吸煙非COPD組比較，吸煙COPD組BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體的濃度亦明顯升高(P<0.05)。對肺組織的RT-PCR檢測結(jié)果也得到相似的結(jié)論，COPD模型大鼠肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，進(jìn)一步證實了NLRP3炎癥小體作為一種肺組織特異性表達(dá)的炎癥介質(zhì)，可能參與了COPD病情的發(fā)生與發(fā)展，其機制可能與引起NEU，AMC，LYM等炎癥細(xì)胞浸潤以及炎性介質(zhì)分泌有關(guān)[13，14]。此外，NEU，AMC和LYM計數(shù)與BALF，肺組織中NLRP3炎癥小體濃度、肺組織NLRP3 mRNA相對表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。由此可見，NEU，AMC和LYM計數(shù)在氣道內(nèi)的聚集可導(dǎo)致NLRP3水平的升高[15]。

綜上所述，香煙熏吸可誘發(fā)大鼠COPD，而NLRP3炎癥小體在COPD的慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，與肺組織炎性細(xì)胞以及氣道病理改變密切相關(guān)，阻斷NLRP3炎性小體的活化有望成為治療COPD新的靶點和方向。