徐冰心 吳瑩瑩 徐冰珠 秦亞亞 司少艷 崔彥

紫外線(Ultraviole,UV)是光波的一種,根據(jù)波長(zhǎng)可分為UVA、UVB和UVC。UVC穿越臭氧層時(shí)一般會(huì)被過(guò)濾掉,不會(huì)對(duì)人體皮膚造成危害,受到關(guān)注較少。但隨著環(huán)境污染導(dǎo)致的臭氧層越來(lái)越薄,地面紫外線強(qiáng)度日益增加,UVC所帶來(lái)的傷害越來(lái)越受到重視。隨著載人航天技術(shù)的迅猛發(fā)展,太空紫外線輻射對(duì)航天員身體健康造成的影響亦受到越來(lái)越多的關(guān)注。UVC又稱短波紫外線,對(duì)人體的傷害很大,短時(shí)間照射即可灼傷皮膚,長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度還可以造成皮膚癌。紫外輻射對(duì)生物體的損傷程度,與輻射的功率和時(shí)間有關(guān)[1-2]。原花青素(procyanidine,OPC)為葡萄籽提取物或法國(guó)海岸松樹皮提取物,屬于特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮,因其結(jié)構(gòu)中存在較多酚羥基而具有較強(qiáng)還原性,因而OPC一直被認(rèn)為是強(qiáng)有效的抗氧化劑。OPC的抗自由基氧化能力分別是維生素E和維生素C的50倍和20倍。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)其生物活性的研究較多,但對(duì)OPC體外抗紫外輻射方面的研究鮮有報(bào)道。皮膚的成纖維細(xì)胞是紫外線照射的重要靶位,本研究以小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(NCTC clone 929,L929)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分析OPC對(duì)受UVC輻射的小鼠成纖維細(xì)胞的作用,討論OPC體外抗紫外線輻射的活性,為OPC在紫外防護(hù)方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料與方法

(一)主要材料和儀器

小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心),倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司),酶聯(lián)免疫光譜分析儀BIO-RAD680(美國(guó)伯樂(lè)公司),二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋),流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國(guó)BD公司),紫外燈(天津合普公司),原花青素(OPC,青島海隆達(dá)生物科技有限公司,純度>95%)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系培養(yǎng)擴(kuò)增

小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系以含10% 胎牛血清及雙抗(100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基,于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)良好的4～10代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

(二)UVC照射

各組細(xì)胞生長(zhǎng)至第4天時(shí),棄去培養(yǎng)基,用溫PBS沖洗兩次,加入適量PBS,紫外燈預(yù)熱5 min,將細(xì)胞培養(yǎng)板開蓋,平放于紫外燈下,紫外燈處于培養(yǎng)板垂直上方,細(xì)胞培養(yǎng)板距離紫外燈垂直距離為30 cm,培養(yǎng)板處劑量率測(cè)得140 μW/cm2,紫外輻射劑量=輻照度×?xí)r間。

(三)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

分為正常對(duì)照組、照射對(duì)照組和給藥組(OPC梯度為25、50、100、200 μg/mL)。UVC照射時(shí)間為357 s,總劑量為50 mJ。實(shí)驗(yàn)分照射前給藥和照射后給藥兩批進(jìn)行。照射前給藥實(shí)驗(yàn):照射前24 h,96孔板每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的OPC,30 min后采用UVC照射,培養(yǎng)24 h,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。照射后給藥實(shí)驗(yàn):6孔板每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h,UVC照射,照射后立即加入不同濃度的OPC,培養(yǎng)24 h,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

(四)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

實(shí)驗(yàn)分別為正常對(duì)照組,照射對(duì)照組,OPC組(25、50、100 μg/mL)。UVC照射時(shí)間為214 s,總劑量為30 mJ。每孔3 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板,每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×105,分5組,UVC照射,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,離心(1 500 rpm,10 min),取1×106個(gè)細(xì)胞,加300 μLPBS重懸,加700 μL預(yù)冷無(wú)水乙醇,混合均勻,置-20℃冰箱內(nèi)固定48 h以上,加2 mL PBS,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入100 μL RNAase(100 μg/mL)室溫放置10 min后,加入PI溶液300 μL(終濃度50 μg/mL),-4℃染色10 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FSC/SSC散點(diǎn)圖對(duì)淋巴細(xì)胞設(shè)門,FL2-W/FL2-A散點(diǎn)圖去除粘連細(xì)胞,FL2-A直方圖區(qū)分G0/G1和G2/M期細(xì)胞,低速獲取細(xì)胞,Modifit軟件分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)與分析

兩組間比較采用 SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 0.05。

結(jié) 果

一、OPC對(duì)UVC照射小鼠L929細(xì)胞活性的影響

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,未經(jīng)UVC照射的正常對(duì)照組細(xì)胞均具有優(yōu)良的細(xì)胞活性,UVC照射后,照射對(duì)照組細(xì)胞活性較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。與照射組對(duì)照比較,照射前或照射后給予一定劑量的OPC對(duì)UVC照射成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞細(xì)胞活性增加,照射前加入25、50、100、200 μg/mL的OPC,可以顯著預(yù)防照射引起的L929細(xì)胞活性下降(P<0.05);照射后立即加入25、50、100 μg/mL的OPC,可以顯著預(yù)防照射引起的L929細(xì)胞活性下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

二、OPC對(duì)UVC照射小鼠L929細(xì)胞周期和凋亡的影響

與正常對(duì)照組比較,UVC照射后24 h照射對(duì)照組細(xì)胞周期S期細(xì)胞百分率顯著增多,凋亡細(xì)胞百分率顯著增多,OPC各組細(xì)胞S期百分率有增多趨勢(shì),100 μg/mL顯著增多(P<0.05),與照射對(duì)照組比較,OPC 25、50 μg/mL組細(xì)胞APO百分率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 OPC對(duì)UVC照射小鼠L929細(xì)胞活性的影響±s,n=3)

注:與正常對(duì)照組相比:aP<0.05;與照射對(duì)照組比較:bP<0.05

表2 OPC對(duì)UVC照射小鼠L929 細(xì)胞周期和凋亡的影響±s,n=3)

注:與正常對(duì)照組相比：aP<0.05;與照射對(duì)照組比較：bP<0.05

討 論

紫外線照射是導(dǎo)致皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的重要因素。紫外輻射作用于正常細(xì)胞,首先主要引起的損傷,細(xì)胞在細(xì)胞周期的特定階段暫時(shí)阻滯而允許損傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。損傷被修復(fù),細(xì)胞周期進(jìn)程恢復(fù),通過(guò)細(xì)胞周期不斷地循環(huán)而完成的細(xì)胞增殖得以繼續(xù),若修復(fù)失誤則細(xì)胞走向凋亡,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。

從葡萄籽中提取得到的OPC是一種雙黃酮衍生物,純天然多酚化合物,兼具有強(qiáng)效抗氧化劑、還原劑和自由基清除劑的功效,多酚類物質(zhì)是具有很強(qiáng)的抗氧化活性及自由基的清除抑制率,能有效保護(hù)正常細(xì)胞功能[4-6]。長(zhǎng)期慢性紫外線照射會(huì)引起皮膚屏障功能損傷,OPC在抵抗紫外線損害、修復(fù)皮膚屏障、抑制光老化方面均具有一定的作用[7],對(duì)急性光損傷所致的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡具有防護(hù)作用[8]。

在UVC照射前及照射后加入一定濃度的OPC,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,照射前30 min加入25、50、100、200 μg/mL的OPC,可以顯著預(yù)防照射引起的L929細(xì)胞活性下降;照射后立即加入25、50、100 μg/mL的OPC,可以顯著預(yù)防照射引起的L929細(xì)胞活性下降。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果認(rèn)為,OPC對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的紫外線照射保護(hù)作用在OPC濃度為25～50 μg/mL范圍內(nèi)作用較好,200 μg/mL輻射防護(hù)作用反而下降,可能因?yàn)镺PC濃度過(guò)高影響細(xì)胞自身的正常生長(zhǎng)。照射前給藥比照射給藥輻射防護(hù)作用好。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明照射前或照射后給予一定劑量的OPC對(duì)UVC照射成纖維細(xì)胞L929 細(xì)胞損傷具有防治作用。

UV作用于正常細(xì)胞,首先主要引起DNA的損傷,細(xì)胞在細(xì)胞周期的特定階段暫時(shí)阻滯而損傷的細(xì)胞能夠進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞無(wú)法修復(fù)UV所致?lián)p傷,細(xì)胞將發(fā)生凋亡以避免細(xì)胞DNA突變的產(chǎn)生與擴(kuò)增,因而凋亡是人體細(xì)胞對(duì)外界損傷(如紫外線輻射)的一種防御性反應(yīng),日光中的UV可增加皮膚組織中的氧自由基,引起氧化損傷,同時(shí)可引起局部和系統(tǒng)免疫抑制和細(xì)胞凋亡,造成DNA損傷誘發(fā)突變,導(dǎo)致皮膚炎癥、曬傷、光老化及皮膚腫瘤。OPC藥理作用機(jī)制是多樣的[9],抑制凋亡起到抗紫外線輻射作用是其中防護(hù)作用機(jī)制之一[10]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),UVC照射后24 h,與正常對(duì)照組比較,照射對(duì)照組細(xì)胞周期S期細(xì)胞百分率顯著增多,凋亡細(xì)胞百分率顯著增多,筆者推測(cè)在照射后24 h,一方面無(wú)法修復(fù)UV所致?lián)p傷的細(xì)胞開始走向凋亡,另一方面,由于照射引起細(xì)胞自在細(xì)胞周期的特定階段暫時(shí)阻滯,在發(fā)生阻滯后,損傷在照射后24 h 細(xì)胞增殖活性恢復(fù),可能是由于細(xì)胞生長(zhǎng)加速,照射后的細(xì)胞會(huì)代償性的增值,從細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)上表現(xiàn)在S期細(xì)胞的百分率較多。筆者在小鼠的γ電離輻射防護(hù)實(shí)驗(yàn)中看到過(guò)類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]。與正常對(duì)照組比較,OPC各組細(xì)胞S期百分率顯著增多,提示OPC可以促進(jìn)L929細(xì)胞的增殖;與照射對(duì)照組比較,OPC 25、50 μg/mL細(xì)胞APO百分率顯著降低,提示OPC可以減少UVC照射引起的細(xì)胞凋亡顯著增多。

總之,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)原花青素對(duì)UVC的輻射損傷作用具有一定的保治作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為原花青素在抗紫外損傷方面的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。