司少艷 徐冰心 吳瑩瑩 秦亞亞 王奎 宋淑軍

膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分,參與細胞間信息的傳遞、細胞的增殖、分化、運動,與組織的形成、細胞免疫、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后的產(chǎn)物。研究顯示膠原蛋白和膠原蛋白肽具有多種生物學活性,如提高免疫活性、促進骨形成、抗氧化、預(yù)防心血管疾病和抑制腫瘤活性等[1-11]。絕大多數(shù)文獻采用口服的方式,本課題組在之前的研究采用腹腔注射的方式給予膠原蛋白肽,發(fā)現(xiàn)也能改善免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究中，筆者探究這兩種給藥方式對小鼠免疫功能的影響。

材料和方法

一、材料

牛骨膠原蛋白肽由中科院理化技術(shù)研究所郭燕川研究員饋贈;地塞米松磷酸鈉注射液購自浙江仙琚制藥股份有限公司;RPMI1640干粉購自美國Gibco公司;MTT購自美國Amresco公司;刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)購自美國Sigma公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;FITC標記的抗小鼠CD3抗體、PE標記的抗小鼠CD4抗體、PE-cy5標記的抗小鼠CD8抗體購自美國eBioscience公司;健康6～8周齡雄性ICR小鼠,購自北京大學醫(yī)學部實驗動物醫(yī)學研究中心。

二、小鼠分組及給藥方案

將ICR小鼠隨機分為10組,每組6只,灌胃組和腹腔注射組均分為對照組、模型組以及100、300、 600 mg膠原蛋白肽/kg體重組。除對照組外,其余各組小鼠腹腔注射25 mg地塞米松/kg體重,1次/d,共3次,造模。造模的同時,膠原蛋白肽組小鼠分別腹腔注射0.2 mL等滲鹽水配制的每千克體重100、300、600 mg膠原蛋白肽,1次/d,連續(xù)7 d;對照組和模型組小鼠同時腹腔注射0.2 mL等滲鹽水,1次/d,連續(xù)7 d。于實驗的第8天,將小鼠摘眼球取血,EDTA抗凝,然后斷頸處死,無菌取脾,分別檢測以下指標。

三、觀察指標

(一)小鼠胸腺、脾臟大小的觀察

分別稱量小鼠體重和胸腺、脾臟重量,計算小鼠胸腺和脾臟指數(shù):胸腺和脾臟的重量(mg)/體重(g)。

(二)小鼠外周血白細胞分類和計數(shù)

采用全自動血球計數(shù)儀檢測小鼠外周血白細胞計數(shù)及分類。

(三)小鼠外周血CD4/CD8比值

取50 μL抗凝血,加1 mL溶血劑,冰水中裂解紅細胞,PBS洗2遍后,加入100 μL含5% 小牛血清的RPMI1640,分別加入1 μL FITC標記的抗小鼠CD3抗體、PE標記的抗小鼠CD4抗體、PE-cy5標記的抗小鼠CD8抗體,室溫避光孵育30 min, PBS洗2次后,加入20 g/L多聚甲醛0.3 mL,進行流式細胞儀分析,分析CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分比,計算CD4/CD8T淋巴細胞比值。

(四)小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的檢測

將脾臟采用載玻片磨碎,過200目細胞篩,制備脾細胞懸液;離心后加入1 mL紅細胞裂解液,室溫放置5～10 min,離心,PBS洗2次;用含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640懸浮細胞,制備1×107/mL的脾細胞懸液;96孔板每孔加100μL脾細胞懸液,加100 μL ConA稀釋液,至ConA終濃度為5 μg/mL,空白孔不加ConA,加100 μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h;每孔加20 μL MTT,培養(yǎng)4～6 h,吸出上清,加100 μL DMSO,測定490 nm的吸光度值(A490),增殖指數(shù)=AConA/A空白。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、不同途徑給予膠原蛋白肽對小鼠胸腺和脾臟大小的影響

與模型組相比,兩種途徑給予膠原蛋白肽,均是從中劑量開始對胸腺指數(shù)的影響有顯著意義(P<0.05),但均仍低于對照組。與模型組相比,灌胃的3個劑量對脾臟指數(shù)都沒有顯著影響(P>0.05),而腹腔注射3個劑量對脾臟指數(shù)均有顯著影響(P<0.05),而且與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同途徑給予膠原蛋白肽對小鼠胸腺、脾臟大小的影響±s)

注:與對照組比較：aP<0.05;與模型組比較：bP<0.05

二、不同途徑給予膠原蛋白肽對小鼠外周血白細胞分類的影響

與模型組相比,腹腔注射膠原蛋白肽3個低劑量組小鼠中性粒細胞百分比及絕對值、淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而且高劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義;灌胃組只有高劑量組上述指標與模型組相比有顯著影響(P<0.05),而且仍與對照組有顯著差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表2、3。

注:a為以前向角和側(cè)向角為坐標做圖,圈定淋巴細胞設(shè)R1門;b為以前向角和CD3標記熒光為坐標做圖,圈定CD3+ T細胞設(shè)R2門;c為CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞流式分析

圖1 CD4+、CD8+ T細胞流式分析圖

注:與對照組比較：aP<0.05;與模型組比較：bP<0.05

表3 灌胃給予膠原蛋白肽對小鼠外周血白細胞分類的影響±s)

注:與對照組比較：aP<0.05;與模型組比較：bP<0.05

三、不同途徑給予膠原蛋白肽對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

與模型組相比,腹腔注射膠原蛋白肽從中劑量組開始小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力均高于模型組(P<0.05);灌胃組只有高劑量組小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力高于模型組(P<0.05)。見表4。

討 論

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞和免疫分子構(gòu)成,具有免疫監(jiān)視、免疫防御和免疫自穩(wěn)的功能,是機體抵御外來微生物入侵以及清除腫瘤細胞的第一道防線。

表4 不同途徑給予膠原蛋白肽對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響±s)

注:與對照組比較：aP<0.05;與模型組比較：bP<0.05

膠原蛋白肽是膠原蛋白的降解產(chǎn)物,研究顯示[1,8-12]膠原蛋白肽可以提高機體的免疫功能。王鳳林等[9]采用環(huán)磷酞胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型,灌胃給予逞羅鱷魚鱗膠原蛋白肽,觀察到膠原蛋白肽對小鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力有提高作用。國內(nèi)學者未用免疫抑制模型,而是直接給小鼠灌胃給予膠原蛋白肽,觀察到小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)升高,遲發(fā)型過敏反應(yīng)升高,反映了T細胞功能的增強[1,8,10]。Fan等[11]觀察到灌胃給予水母膠原蛋白肽可以改善紫外線輻射引起的胸腺和脾臟的萎縮。本課題組前期研究顯示,腹腔注射膠原蛋白肽能夠提高糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫功能[12]。本研究中我們采用腹腔注射和灌胃兩種途徑給予膠原蛋白肽,觀察其對小鼠的免疫功能的改善作用,以尋找最佳的給藥途徑。

本研究結(jié)果顯示,與模型組相比,腹腔注射膠原蛋白肽從低劑量開始對小鼠脾臟指數(shù),從中劑量開始對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力均具有顯著改善作用,而且腹腔注射3個劑量組脾臟指數(shù)與對照組無顯著差異;而灌胃給予膠原蛋白肽組均對脾臟指數(shù)無影響,且只有高劑量組對小鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力有顯著改善作用。

外周血免疫細胞包括粒細胞、淋巴細胞和單核細胞。中性粒細胞具有很強的變形能為和趨化作用,能夠吞噬和消化細菌。淋巴細胞包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞(nature killer cell,NK)。T淋巴細胞主要參與細胞免疫,B淋巴細胞主要參與體液免疫,在防御病毒、細菌等的入侵及抗腫瘤發(fā)揮重要的功能。與模型組相比,腹腔注射膠原蛋白肽3個低劑量組小鼠中性粒細胞百分比及絕對值及淋巴細胞百分比均有顯著改善作用,而且高劑量組與對照組無顯著差異;而灌胃組只有高劑量組上述指標與模型組相比有顯著影響,但仍與對照組差異有統(tǒng)計學意義。

外周血成熟T淋巴細胞主要包括CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞2個亞群。從功能上來看,CD4+T細胞主要是輔助性T細胞,CD8+T細胞包括殺傷性T細胞和抑制性T細胞。在正常情況下,CD4/CD8比值保持動態(tài)平衡,以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當比值下降甚至倒置時,表明機體處于免疫功能低下甚至免疫抑制狀態(tài)。通常情況下免疫功能低下的艾滋病患者[13]和腫瘤患者[14-15]外周血CD4/CD8比值降低,甚至倒置。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠外周血CD4/CD8比值低于對照組,經(jīng)腹腔注射和灌胃給予膠原蛋白肽后,均使CD4/CD8比值回升,并呈劑量依賴性關(guān)系。腹腔注射膠原蛋白肽從低劑量開始,而灌胃給予膠原蛋白肽只是高劑量才顯著提高CD4/CD8比值,并且腹腔注射高劑量組與對照組無顯著差異,使小鼠由免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)向正常水平。而灌胃高劑量組仍顯著低于對照組,小鼠仍處于免疫抑制狀態(tài)。

膠原蛋白肽是膠原蛋白的降解產(chǎn)物,膠原蛋白中含有多個生物活性基團,但在空間結(jié)構(gòu)上其活性中心可能包埋在膠原蛋白的內(nèi)部,因此通過水解得到的膠原蛋白肽,其活性中心充分暴露,更有利于發(fā)揮其生物學功能[16]。造成上述腹腔注射優(yōu)于灌胃給予膠原蛋白肽的研究結(jié)果,原因可能是與灌胃相比,腹腔注射膠原蛋白肽避免了因消化道蛋白酶對膠原蛋白肽活性基團可能造成的破壞作用。具體機制有待進一步研究揭示。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，對免疫抑制小鼠免疫功能的改善作用，腹腔注射優(yōu)于灌胃給予膠原蛋白肽。