張秋妍，趙 靜，孫晶晶，張芙蓉，趙海君，屈長青*

（阜陽師范學院 a.生物與食品工程學院；b.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽 236037）

疏毛羅勒（Ocimum basilicum Linn var.ppilosum(wild.)Benth），一年生草本植物，為唇形科植物，是一種藥食兩用植物，全草入藥，治胃腸脹氣、消化不良、腸炎腹瀉、外感風寒、跌打損傷瘀腫、風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，可廣泛應(yīng)用于食用、食品工業(yè)、日用化工和醫(yī)藥保健等方面，目前在河南、安徽淮河以北多有種植。羅勒多糖是其中重要的生物活性物質(zhì)[1]，而目前對羅勒多糖的研究主要集中在腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、抗血栓抗氧化等相關(guān)方面[2]，本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，羅勒多糖與維生素C一樣，對酪氨酸酶有抑制作用，并且抑制作用明顯[3]，但羅勒多糖用在對巨噬細胞影響方面鮮有報道。

巨噬細胞（Macrophages）屬于免疫細胞，在脊椎動物體內(nèi)參與非特異性防衛(wèi)（先天性免疫）和特異性防衛(wèi)（細胞免疫），主要功能是吞噬細胞殘片及病原體，并激活淋巴球或其它免疫細胞，令其對病原體作出反應(yīng)，促進機體康復(fù)[4-5]。本文探究了羅勒多糖對體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的影響，為羅勒新藥用價值的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

昆明小白鼠（購于安徽醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心）；疏毛羅勒（購于阜陽農(nóng)貿(mào)市場，為當年4月份采摘，洗凈晾干）；低糖 DMEM（貨號11885500BT，Gibco）；小牛血清（貨號 11011-8611，杭州四季青）；中性紅（貨號N835635，上海麥克林）；CO2培養(yǎng)箱（Forma3111，美國 Thermo Scientific Forma公司）；全自動酶標儀（ELX800，美國Bio-Tek公司）；倒置顯微鏡（ckx31，日本OLYMPUS公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅勒多糖的提取

采用水煮醇沉法[6]：取陰干的羅勒，粉碎機粉碎待用。稱取40 g羅勒粉末加200 mL蒸餾水浸泡24 h，90℃加熱1 h，紗布過濾，3 500 r/min離心15 min，取上清液，加入4倍體積無水乙醇，4℃低溫靜置24 h醇沉，3 500 r/min離心15 min，先后用無水乙醇、丙酮、無水乙醚脫脂純化，用蒸餾水溶解沉淀（不離心），用Sevag法去除蛋白[Sevag液為氯仿∶戊醇=4∶1（V∶V），濃縮液∶Sevag液=4∶1，充分振搖30 min，3 500 r/min離心5 min]，重復(fù)多次，收集上清液，加入無水乙醇使乙醇濃度達到80%，4℃低溫靜置24 h醇沉，3 500 r/min離心15 min，沉淀物在50℃水浴鍋蒸發(fā)，然后自然晾干至恒重，干品即為羅勒粗多糖。稱100 mg溶于10 mL的蒸餾水，充分溶解，即為10 mg·mL-1的羅勒多糖溶液。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細胞的提取與純化

將小鼠斷頸處死，75%的乙醇浸泡5 min，置入超凈工作臺內(nèi)固定。無菌條件下把小鼠腹部皮膚剪開一條線，然后雙手持鑷子撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露腹膜，用注射器吸取無菌DMEM 4～6 mL注入小鼠腹腔，然后輕柔小鼠腹腔5 min再反復(fù)吸回DMEM，1 000 r/min離心10 min，棄上清加入紅細胞裂解液 5 mL，離心，重復(fù)兩次。用DMEM低糖培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，以2×105～4×105個/cm2的密度接種細胞于96孔板，每孔120μL。放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后吸棄培養(yǎng)液并用DMEM洗去未貼壁細胞，獲得的貼壁細胞即為純化的巨噬細胞[5]。然后加入羅勒多糖濃度梯度培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 中性紅法測定巨噬細胞吞噬活性[7]

羅勒多糖濃度梯度培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后每孔加入100μL的0.1%中性紅懸濁液，繼續(xù)孵育4 h后棄去孔內(nèi)液體，用PBS液緩慢沖洗3次，然后每孔加120μL細胞裂解液[無水乙醇∶冰乙酸=1∶1（V∶V）]，于微孔振蕩器上震蕩 15 min，用酶標儀在490 nm處測定吸光度（OD），以O(shè)D值表示巨噬細胞吞噬功能的強弱。計算吞噬率，巨噬細胞吞噬率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學的方法，對數(shù)據(jù)進行分析，文中所用的數(shù)據(jù)都是以（平均數(shù)±標準差）表示，采用SPSS 21.0對實驗組和對照組進行顯著性差異分析，當P＜0.05時，說明實驗組與對照組有顯著性差異，其中，當P＜0.01時，說明實驗組與對照組之間有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 羅勒多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活力影響

由圖1可知，隨羅勒多糖濃度升高巨噬細胞OD值增大，表明羅勒多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性有促進作用，濃度升到100/μg·mL-1時，與對照組相比達到極顯著水平。

圖1 羅勒多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活力的影響*表示與對照組相比，P＜0.05；**表示與對照組相比P＜0.01

2.2 不同濃度的羅勒多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率的影響

由吞噬曲線可以看出，羅勒多糖在0～100 μg·mL-1范圍內(nèi)吞噬率明顯升高，100 μg·mL-1之后吞噬率增加的緩慢。

圖2 不同濃度的羅勒多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率的影響

3 討論

羅勒多糖是疏毛羅勒的重要生物活性物質(zhì)[1]，而目前對羅勒多糖的研究主要集中在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、降血糖血脂等相關(guān)方面，趙慶華等通過Metrigel穿膜法體外觀察羅勒多糖對腫瘤細胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)羅勒多糖后的PG細胞，穿過人工基底膜的細胞數(shù)顯著減少，對黑色素瘤B16-F10人工肺自發(fā)性轉(zhuǎn)移行為具有明顯的抑制作用并對細胞通訊功能缺陷的PG細胞具有一定程度的恢復(fù)作用[8]，陳鋒等研究了羅勒水提取物和多糖對高血脂和高血糖大鼠模型的降低作用，實驗發(fā)現(xiàn)其具有降血糖和降血脂作用[9]，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，羅勒多糖與維生素C一樣，對酪氨酸酶有抑制作用，并且抑制作用明顯[2]，但羅勒多糖用在對巨噬細胞影響方面鮮有報道，米娜瓦爾·哈帕爾等發(fā)現(xiàn)羅勒提取物體外對經(jīng)脂多糖刺激的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞生長的最大抑制質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1，對細胞內(nèi) 5-脂氧酶活性具有抑制作用[10]。還有研究表明，羅勒多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種供試菌的生長有抑制作用[11]，羅勒多糖還能提高荷瘤小鼠NK細胞的殺傷活性[1]。

尚慶輝等報道植物多糖可以通過增大巨噬細胞體積、提高吞噬活力、調(diào)節(jié)巨噬細胞細胞因子的分泌量來提高機體免疫力[12]。另外有文獻報道植物多糖可通過NF-κB信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生免疫應(yīng)答，并且可以通過TLR4、TLR2受體介導(dǎo)巨噬細胞激活細胞內(nèi)信號通路，促進相關(guān)細胞因子的釋放，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能[13]。本實驗通過小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅顆粒，發(fā)現(xiàn)羅勒多糖具有較強的增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，提高機體免疫功能。羅勒多糖能夠提高機體提高巨噬細胞的吞噬能力的機制可能與引起巨噬細胞NF-κB活性有關(guān)，也可能通過TLR4、TLR2受體介導(dǎo)巨噬細胞激活細胞內(nèi)信號通路，促進相關(guān)細胞因子的釋放，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，其具體作用機制還需通過對TNF-α、ROS、NO等細胞因子的合成量的測定來進一步驗證。另外本實驗采用的水煮醇沉法提取的羅勒多糖為粗多糖，粗多糖中的具體成分還需進一步進行分離、提純、試驗驗證。但羅勒多糖能夠提高機體免疫監(jiān)視已被再次證明，并可能成為一種增強免疫的新型藥物，本實驗也為羅勒多糖藥用價值的進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 小結(jié)

近年來有關(guān)羅勒多糖在對巨噬細胞影響方面報道較少，本實驗采用的水煮醇沉法提取羅勒多糖，用不同濃度的羅勒多糖處理小鼠腹腔巨噬細胞，測定羅勒多糖對巨噬細胞的吞噬活力。隨著羅勒多糖濃度的升高，巨噬細胞的吞噬活力增強，當羅勒多糖濃度達到100μg·mL-1時，與對照組相比達到極顯著水平（P<0.01），提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率的羅勒多糖最佳濃度是100μg·mL-1。綜上可得羅勒多糖可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活力。