葉利芳 ，舒曉明 ，左 瑜 ，楊闞波 ，陳 賀 ，張亞妹 ，王國春 ，?

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，北京 100029；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 研究生院，北京 100730）

皮肌炎（dermatomyositis，DM）是一組病因尚不明確、臨床上以四肢近端肌無力、肌痛及皮膚病變?yōu)樘卣鳎怨趋兰⊙装Y浸潤為特征性病理改變的自身免疫性疾病，也可伴發(fā)嚴(yán)重的呼吸、消化、循環(huán)等多系統(tǒng)損害[1]。肌肉病變?yōu)镈M的主要病變之一，目前DM肌肉病變的確切病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

大量研究表明miRNA參與各種疾病的發(fā)病機(jī)制，如自身免疫性疾病[2]。新近發(fā)現(xiàn)的miR-23b-3p是一種炎癥相關(guān)的miRNA，可調(diào)節(jié)許多炎性細(xì)胞因子，例如NF-κB，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-17，參與多種自身免疫性疾病[6]。Zhu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中表達(dá)下調(diào)，通過靶向TGF-β激活的激酶1/MAP3K7結(jié)合蛋白 2 （TGF-β-activated kinase 1/MAP3K7 binding protein2，TAB2）、TAB3 和核因子 κ-B 激酶亞基抑制劑 α（inhibitor of nuclear factor κ-B kinase subunit α，IKK-α）抑制IL-17水平進(jìn)而參與疾病發(fā)病。但迄今為止，miR-23b-3p在DM中的作用尚未研究。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測DM患者中的miR-23b-3p的表達(dá)水平，并分析其和臨床特征的相關(guān)性，初步探討其在DM中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2011年3月～2016年2月于中日友好醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院治療的活動期DM患者49例，其中男16例、女33例；全部患者均符合1975年Bohan／Peter的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有入選病例均排除合并感染及其他自身免疫性疾病。收集同期在我院體檢的經(jīng)年齡、性別匹配的健康體檢人群血清作為對照。所有血清采集分離之后均于-80°C凍存直至檢測時(shí)使用。本研究已通過我院倫理委員會（2016117）批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 臨床指標(biāo)檢測

常規(guī)實(shí)驗(yàn)室評估包括確定血清肌酸激酶（CK），乳酸脫氫酶（LDH），紅細(xì)胞沉降率（ESR），C-反應(yīng)蛋白（CRP），均在中日友好醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測血清中抗Jo-1、PL-7、PL-12、EJ、OJ、Mi2、SRP、MDA5、NXP2、TIFl-1 和SAE抗體 （試劑盒購自德國歐蒙公司），采用ELISA法檢測血清中抗HMGCR抗體 （試劑盒購自美國Inova Diagnostics公司）。根據(jù)國際肌炎預(yù)后評估協(xié)作組 （international myositis outcome assessment co11aboration study，IMACS）推薦使用視覺模擬評分 （physician's global assessment，PGA）（范圍0～10cm）評估DM患者的疾病活動性。

1.3 血清總RNA提取

根據(jù)制造商的說明書使用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）從1ml血清中提取總RNA，并最終溶解于20μl無RNase的水中；采用紫外分光光度計(jì)K5500（中國）對獲得的總miRNA進(jìn)行純度和濃度檢測，合格樣品的吸光度A260/280在1：8～2：1之間；然后進(jìn)行凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

采用TIANGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根，中國）對血清提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)引物（銳博，中國），頸環(huán)法檢測，以celmiR-39-3p為內(nèi)參基因，采用miRNA qPCR Starter Kit（銳博，中國）行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，然后采用CFX96 RTPCR儀（Bio-Rad公司，美國）上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測各樣本Ct值。每種樣品采用相同體系及條件同時(shí)進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增。為驗(yàn)證預(yù)期PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性和特異性，進(jìn)行解鏈曲線分析。△CT=目的基因平均 CT值-內(nèi)參平均CT值，計(jì)算2-△△Ct作為miRNA的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 19.0軟件；計(jì)量資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性評估。

2 結(jié)果

表1 DM患者臨床資料

2.1 DM患者的臨床資料

表1示，49例DM患者年齡47±10歲，常見的臨床癥狀為皮疹（93.8%）、肌無力（75.5%）、肌痛（46.9%）、關(guān)節(jié)炎/痛（38.7%）、發(fā)熱（26.5%）等，肌炎特異性抗體（myositis specific autoantibodies，MSAs）陽性率為 81.6%（40/49），約有 51%（25 例）的患者合并有肺間質(zhì)病變 （interstitial lung disease，ILD），合并食管受累者有 11例 （22.4%），4例（8%）患者有雷諾現(xiàn)象。

2.2 miR-23b-3p在DM患者血清中的表達(dá)

DM患者血清中miR-23b-3p相對表達(dá)量為1.98±0.86，健康對照組miR-23b-3p相對表達(dá)量為 3.02±1.13，2 組具有顯著性差異 （P＜0.01），結(jié)果見圖1。

2.3 DM患者血清miR-23b-3p表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性

我們進(jìn)一步分析常見臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，結(jié)果表明，DM患者血清miR-23b-3p相對表達(dá)量與“技工手”[1.20 （0.93，1.93）]的發(fā)生相關(guān)（Z=-2.302，P=0.021）；miR-23-3p 與肌痛、 肌無力、吞咽困難、關(guān)節(jié)疼痛、雷諾現(xiàn)象和肺間質(zhì)病變等常見臨床癥狀的出現(xiàn)不相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果表明，miR-23b-3p與CK水平呈負(fù)相關(guān) （r=-0.286，P＜0.05）；與血沉（ESR）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶 （LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及疾病活動度水平均無相關(guān)性，詳見表2及表3。

2.4 不同CK水平的miR-23b-3p表達(dá)水平比較

為進(jìn)一步明確DM患者血清miR-23b-3p與CK的相關(guān)性，將實(shí)驗(yàn)組分為CK正常組（35例）與CK升高組（14例），并比較其miR-23b-3p表達(dá)水平，結(jié)果顯示CK升高組miR-23b-3p（1.61±0.19）顯著低于 CK 正常組（2.15±0.15，P＜0.05），見圖2。

圖1 DM患者血清中miR-23b-3p表達(dá)水平下調(diào)

表2 DM患者血清中miR-23b-3p表達(dá)水平與臨床癥狀的比較

表3 DM患者血清中miR-23b-3p表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

3 討論

圖2 不同CK水平的miR-23b-3p的表達(dá)水平比較

已有研究表明miRNA參與各種疾病的發(fā)病機(jī)制，如miRNA參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制[8]。有報(bào)道多個miRNA在皮肌炎中的表達(dá)差異，如Inoue K等研究發(fā)現(xiàn)miR-223在DM皮膚和血清中表達(dá)下調(diào)并參與蛋白激酶C水平調(diào)節(jié)[3]，Oshikawa Y等研究表明在DM血清和皮膚中表達(dá)下調(diào)的miR-7與Gottron’s皮疹的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[4]，有部分miRNA參與肌肉損傷過程，Yin等研究表明DM患者肌肉組織中表達(dá)下調(diào)的miR-146a通過靶向TRAF6和影響IL-17/ICAM-1途徑調(diào)節(jié)炎性巨噬細(xì)胞浸潤進(jìn)而參與肌肉炎性損傷[5]。這些研究均表明miRNA參與DM的發(fā)病。

在炎性疾病患者的血清樣品中存在循環(huán)的細(xì)胞外miRNA，可能由炎性細(xì)胞或組織產(chǎn)生，因此血清miRNA的變化可以反映疾病狀態(tài)[9]。近年來miRNA在DM發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制越來越受到重視。研究顯示，miR-23b通過調(diào)節(jié)多種不同的免疫細(xì)胞和炎癥因子參與自身免疫性發(fā)病機(jī)制[6]。在DM患者的血液和炎癥肌肉損傷中發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞和炎癥因子直接參與肌纖維損傷[10]，故推測miR-23b-3p在DM肌肉損傷發(fā)病過程中起作用。

本研究首次證實(shí)DM患者血清miR-23b-3p表達(dá)下調(diào)，與CK水平負(fù)相關(guān)，與技工手的發(fā)生有關(guān)，提示miR-23b-3p可能是參與DM肌肉損傷的重要分子。Martina等研究顯示，與健康對照組相比，miR-23b-3p的表達(dá)在IIM患者的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。本研究DM患者血清miR-23b-3p表達(dá)下調(diào)，推斷miR-23b-3p在皮肌炎致病機(jī)制中的調(diào)節(jié)作用可能不在PMBC中發(fā)生[11]。新近研究顯示，miR-23b-3p在肌營養(yǎng)不良患者中表達(dá)顯著下調(diào)，該研究為miR-23b-3p參與皮肌炎患者肌肉損傷過程提供了有力的證據(jù)[11]。但確切機(jī)制尚不清楚，miR-23b可能通過調(diào)節(jié)多種不同的免疫細(xì)胞和炎癥因子共同參與皮肌炎肌肉損傷過程。Zhu等[7]研究顯示，在RA或SLE中下調(diào)的miR-23b-3p靶向TAB2、TAB3和IKK-α mRNA轉(zhuǎn)錄物，通過限制關(guān)鍵促炎性細(xì)胞因子IL-17，IL-1β和TNF的作用來抑制自身免疫癥狀。IL-17在DM中的發(fā)病機(jī)理也有報(bào)道[13]。因此推測，miR-23b-3p可能通過靶向調(diào)控IL-17的表達(dá)，從而介導(dǎo)DM的肌肉損傷。

Oshikawa等研究發(fā)現(xiàn)，皮肌炎患者中皮膚與血清中miR-7的表達(dá)顯著下調(diào)，并認(rèn)為血清miR-7可能是診斷皮肌炎的分子標(biāo)記物[14]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p在DM中有技工手患者中的表達(dá)水平顯著低于無技工手患者，其原因尚不清楚，是否可以作為區(qū)分皮肌炎患者有無技工手的分子標(biāo)記物也有待進(jìn)一步的研究。