周濤，呂云霞，陳萬(wàn)志，許德斌，謝嶸，熊騁峰，張書(shū)勇，余濟(jì)春

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 甲狀腺外科，江西 南昌 330006）

甲狀腺癌是目前最為常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1-2]，其來(lái)源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的癌變。約占全身惡性腫瘤的1.3%～1.5%，且近些年增長(zhǎng)趨勢(shì)非常明顯[3-4]。其病理類型主要包括乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌及未分化癌等[5]。其中，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺惡性腫瘤中最常見(jiàn)的類型，約占85%～90%[6]?；颊叨嘁?jiàn)于青年女性[7]，PTC局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，少數(shù)可出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。其治療方法主要有手術(shù)治療、放射性碘核素治療、術(shù)后的甲狀腺激素抑制治療以及最新的生物治療[9]（其中主要是分子靶向藥物）等。大部分的患者預(yù)后良好，生存率高[10]，但仍有少數(shù)約10%～20%的患者因未分化癌或復(fù)發(fā)的分化型甲狀腺癌而死亡。另外，部分分化型甲狀腺癌包括PTC因首次手術(shù)方式不規(guī)范或出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)需再次手術(shù)，而再次手術(shù)難度以及手術(shù)的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)大大增加[11]。這類現(xiàn)有治療手段難以取得較好療效的分化型甲狀腺癌被稱為難治性分化型甲狀腺癌，亟待探索新的治療方案予以解決。難治性甲狀腺癌一直以來(lái)就是甲狀腺疾病治療所面臨的難關(guān)之一。美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)的研究數(shù)據(jù)顯示，影響甲狀腺癌患者5年生存率的最主要因素是局部晚期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)的發(fā)展，基因治療成為近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)，學(xué)術(shù)上也不斷涌現(xiàn)相關(guān)科研成果，許多靶向藥物應(yīng)用于臨床，并取得了良好的效果，預(yù)后也顯著提高[13]?；蛑委熢絹?lái)越被臨床醫(yī)生和患者所認(rèn)知和接受，靶向藥物具有針對(duì)性強(qiáng)、副作用小、療效明顯的特點(diǎn)，因此新型靶向藥物的應(yīng)用及基因治療的普及為難治性甲狀腺癌患者帶來(lái)新的希望[14]。

有越來(lái)越多的證據(jù)表明，組織蛋白酶H（cathepsin H，CTSH）在乳腺癌，黑色素瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，結(jié)直腸癌和前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)升高，CTSH能夠參與上述不同腫瘤的發(fā)生過(guò)程，如血管生成，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和侵襲等[15]。CTSH和其它蛋白酶還可能參與細(xì)胞外基質(zhì)組分的破壞，從而導(dǎo)致癌癥的增殖，遷移和轉(zhuǎn)移[16]。蛋白酶的作用在許多方面對(duì)于細(xì)胞或組織的功能是決定性的，任何對(duì)蛋白酶運(yùn)輸?shù)母蓴_都會(huì)導(dǎo)致蛋白水解作用的調(diào)節(jié)改變，進(jìn)而導(dǎo)致甲狀腺癌發(fā)生和進(jìn)展。而對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中蛋白酶的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的理解，為尋找新的治療方法中的藥物靶點(diǎn)提供了線索。本研究旨在探討CTSH在PTC組織中的表達(dá)及其與甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。進(jìn)一步分析CTSH在不同甲狀腺組織中的表達(dá)差異與PTC的臨床病理特征之間的關(guān)系。為臨床病理診斷、基因診療和預(yù)后估計(jì)等方面提供參考指標(biāo)，對(duì)于探討新的可行的治療方法具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，并征得患者知情同意后，收集2016年7月—2016年12月間南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院甲狀腺外科手術(shù)切除的標(biāo)本，其中PTC組織50例，甲狀腺癌旁組織（即相應(yīng)癌組織旁1 cm內(nèi)甲狀腺組織）50例，另取50例相應(yīng)的正常甲狀腺組織作為對(duì)照。所有患者術(shù)前均未行相關(guān)藥物治療、放療及化療。所有標(biāo)本均在離體后0.5 h內(nèi)完成采集，其中一部分放入液氮保存用于RNA及蛋白的表達(dá)檢測(cè)，另一部分用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。所有標(biāo)本病理類型在術(shù)后均有病理科專家報(bào)告證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前合并其他腫瘤；再次手術(shù)及復(fù)發(fā)；南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院術(shù)后病理診斷為PTC合并甲狀腺其他病理類型癌（如合并髓樣癌、濾泡狀癌等） 。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 蛋白提取試劑盒（北京普利萊），凝膠制備試劑盒（博士德生物），ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo），酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物（北京中杉金橋），內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑（北京中杉金橋），一抗：兔抗人CTSH單克隆抗體（英國(guó)Abcam），Alpha Tubulin Antibody Mouse Monoclonal（美國(guó)Proteintech），二抗：相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗體（上海碧云天生物），RNA提取試劑盒（美國(guó)OMEGA），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa），SYBR? Premix Ex Taq? II（日本TaKaRa），CTSH及內(nèi)參 GAPDH引物設(shè)計(jì)與合成由南京金斯瑞生物提供，CTSH上游引物5'-CAA CTG GAG GAA GAT AAA CG-3'，下游引物5'-GCT GAG CAA TTC TGA GGC-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物 5'-CAG GGC TGC TTT TAA CTC TGG T-3'，下游引物5'-GAT TTT GGA GGG ATC TCG CT-3'。

1.2.2 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500（美國(guó)BIORAD），ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIORAD），低溫超速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Forma），垂直電泳儀（美國(guó)BIORAD）。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法

分別取PTC組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織各50 mg，液氮研磨后提取總RNA，采用分光光度儀測(cè)定RNA純度及濃度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。以RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行cDNA 合成，反轉(zhuǎn)錄條件如下：37 ℃5 min； 85 ℃ 5 s，將所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體積為20 μL：2.0 μL cDNA模板，1.6 μL CTSH或GAPDH引物，10 μL SYBR? Premix Ex Taq? II，6.4 μL雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃復(fù)性32 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，不加模板組做為陰性對(duì)照，各樣品均須設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)操作2次，設(shè)定實(shí)驗(yàn)閾值，求出平均CT（cycle threshold）值，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，按照公式計(jì)算出樣品的相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCT值表示，計(jì)算公式為：RQ值=2-△△CT，△△CT=（實(shí)驗(yàn)組目的基因CT值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參CT值）/（對(duì)照組目的基因CT值-對(duì)照組內(nèi)參CT值）。使用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法分析CTSH m R N A相對(duì)定量值，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 Western blot法

分別取PTC組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織各50 mg，液氮研磨后，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品和上樣緩沖液混勻后煮沸10 min上樣，在其兩側(cè)加蛋白Marker 10 μL，SDS-PAGE凝膠電泳（80 V約30 min，120 V約1.5 h）。轉(zhuǎn)膜（260 mA 1 h）至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST緩沖液洗膜 10 min×3次；分別加入CTSH或Tubulin一抗后4 ℃過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜10 min×3次。分別加入二抗，室溫孵育1 h，TBST 緩沖液充分洗膜，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行顯色，ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光顯影，對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。目標(biāo)蛋白CTSH的相對(duì)表達(dá)量用CTSH蛋白與 GAPDH蛋白的灰度比值表示。

1.5 免疫組織化學(xué)SP法

石蠟包埋組織4 μm連續(xù)切片，使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，pH 6.0檸檬酸緩沖液抗原微波修復(fù)10 min，非免疫動(dòng)物血清封閉，滴加稀釋的CTSH一抗孵育4 ℃過(guò)夜，PBS液沖洗后加酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min，PBS液沖洗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。此檢測(cè)中，使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。在顯微鏡下確定細(xì)胞染色強(qiáng)度，無(wú)著色為陰性（-），淡黃色為弱陽(yáng)性（+），棕黃色為中度陽(yáng)性（++），棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[17]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)，兩組間的數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTSH mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

PTC中CTSH mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織及正常甲狀腺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。癌旁組織和正常甲狀腺組織中CTSH mRNA的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖1）。

2.2 CTSH蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果

PTC中CTSH 蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織及正常甲狀腺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。癌旁組織和正常甲狀腺組織中CTSH蛋白的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖2）。

圖1 CTSH mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)Figure1 Determination of the relative expression levels of CTSH mRNA

圖2 CTSH蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)Figure2 Determination of the relative expression levels of CTSH protein

2.3 CTSH蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，CTSH的表達(dá)主要位于細(xì)胞漿中，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核中。本組PTC組織中（-）8例，（+）4例，（++）16例，（+++）22例；癌旁組織中（-）46例，（+）3例，（++）1 例，（+++）0例；正常甲狀腺組織中（-）47例，（+）2 例，（++）1例，（+++）0例。CTSH蛋白在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于其在癌旁組織（84.0%vs.8.0%）與正常甲狀腺組織（84.0%vs.6.0%）（均P＜0.05）的表達(dá)（圖3）（表1）。

圖3 CTSH蛋白免疫組化檢測(cè)（×400） A-B：CTSH蛋白在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)；C：癌旁組織中的陰性表達(dá)；D：正常甲狀腺組織中的陰性表達(dá)Figure3 Immunohistochemical staining for CTSH protein (×400) A–B: Positive expression of CTSH protein in PTC tissue;C: Negative expression of CTSH protein in tumor adjacent tissue; D: Negative expression of CTSH protein in normal thyroid tissue

表1 CTSH蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較[n=50，n（%）]Table1 Comparison of positive expression rates of CTSH protein [n=50, n (%)]

2.4 CTSH蛋白的表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系

CTSH蛋白的表達(dá)與PTC患者的性別、年齡以及腫瘤直徑之間的無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05），而與浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)，即浸潤(rùn)被膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CTSH蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未浸潤(rùn)被膜、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（均P＜0.05）（表2）。

表2 CTSH蛋白的表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table2 Relations of CTSH protein expression with the clinicopathologic factors of PTC patients [n (%)]

3 討 論

CTSH是一種具有硫醇內(nèi)切酶和氨基肽酶活性的內(nèi)肽酶，因首次從小鼠肝臟組織中分離而命名[18]。CTSH基因定位于15q24-q25，分子量28 kDa，有兩種結(jié)構(gòu)形式，最適pH7.0[19]。由該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，具有水解羧肽酶和氨肽酶活性，在各種組織中廣泛表達(dá)。CTSH具有限制底物進(jìn)入它們活性中心的特征。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)PTC組織中CTSH mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織及正常甲狀腺組織，癌旁組織和正常甲狀腺組織中CTSH mRNA及蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。故推測(cè)CTSH在PTC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能具有重要的作用。研究表明，CTSH參與不同的腫瘤發(fā)生的過(guò)程，如血管生成，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和侵襲，CTSH的表達(dá)在一些腫瘤中上調(diào)，包括乳腺癌，黑色素瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，結(jié)直腸癌和前列腺癌等，CTSH和其它蛋白酶可能參與細(xì)胞外基質(zhì)組分的破壞，從而導(dǎo)致癌癥的增殖，遷移和轉(zhuǎn)移[16]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，CTSH蛋白在PTC中的表達(dá)與患者的性別、年齡以及腫瘤直徑之間的關(guān)系無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05），與浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系存在明顯關(guān)系（均P＜0.05）。且浸潤(rùn)被膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CTSH的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未浸潤(rùn)被膜、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。這與上述文獻(xiàn)報(bào)道CTSH可能導(dǎo)致癌癥的增殖和轉(zhuǎn)移一致，提示CTSH蛋白的高表達(dá)可能是PTC的侵襲以及轉(zhuǎn)移重要因素。由于CTSH蛋白在正常甲狀腺組織中低表達(dá)，因此設(shè)法干擾CTSH的表達(dá)就可能起到抑制PTC侵襲轉(zhuǎn)移的作用，而又不影響人體正常甲狀腺組織的功能，達(dá)到特異性治療PTC的目的，成為甲狀腺癌的基因治療的靶點(diǎn)。在腫瘤患者的死因中，細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜被降解起著重要的作用，它們可以通過(guò)蛋白水解的作用從而促進(jìn)腫瘤組織的空間擴(kuò)展、腫瘤新生血管的形成以及血管內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[19-20]。組織蛋白酶在不同細(xì)胞中的作用不同，有的能夠降解胞內(nèi)蛋白，生成抗原肽，有的則能降解不變鏈，從而參與到機(jī)體的自身免疫反應(yīng)[19,21-22]。Oda等[23]的研究中，探討了甲狀腺球蛋白可以調(diào)節(jié)溶酶體內(nèi)肽酶組織蛋白酶的表達(dá)和功能，發(fā)現(xiàn)在大鼠FRTL-5甲狀腺細(xì)胞系甲狀腺球蛋白誘導(dǎo)CTSH mRNA和蛋白的表達(dá)，以及CTSH的酶活性。表明CTSH參與溶酶體介導(dǎo)的激素前體的降解，并且甲狀腺球蛋白通過(guò)激活CTSH相關(guān)蛋白水解途徑刺激激素前體的活化。

CTSH在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不明確。Tsushima等[24]的研究證實(shí)，盡管CTSH在腫瘤進(jìn)展中的作用尚不清楚，但是CTSH在腫瘤進(jìn)展中的可能在降解纖維蛋白原和纖維蛋白方面起作用。CTSH和其他蛋白酶可能參與細(xì)胞外基質(zhì)組分的破壞，導(dǎo)致癌癥增殖，遷移和轉(zhuǎn)移。Tedelind等[25]的研究表明甲狀腺癌組織中的半胱氨酸組織蛋白酶可以通過(guò)其他方式促進(jìn)癌癥進(jìn)展，而不是通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)遷移細(xì)胞。蛋白水解活性變異的半胱氨酸組織蛋白酶與DNA相關(guān)蛋白和其他核蛋白的相互作用可能在甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)展中的發(fā)揮作用。其他的研究報(bào)道，蛋白質(zhì)分解的亞細(xì)胞定位是調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵步驟，蛋白酶的作用在許多方面對(duì)于細(xì)胞或組織的功能是決定性的，任何對(duì)蛋白酶運(yùn)輸?shù)母蓴_都會(huì)導(dǎo)致蛋白水解作用的調(diào)節(jié)改變，進(jìn)而導(dǎo)致甲狀腺癌發(fā)生和進(jìn)展。而對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中蛋白酶的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的理解，為尋找新的治療方法中的藥物靶點(diǎn)提供了線索[26]。

目前，國(guó)內(nèi)外研究CTSH與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的文獻(xiàn)較多，但對(duì)其與甲狀腺腫瘤關(guān)系的報(bào)道仍較少。本研究探討了CTSH在不同甲狀腺組織中的表達(dá)差異，證實(shí)了CTSH與PTC的發(fā)生存在某種關(guān)系。但其通過(guò)何種機(jī)制作用于PTC的發(fā)生，有待于下一步的研究。相信未來(lái)隨著對(duì)CTSH作用和調(diào)控機(jī)制的更深入研究，其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用能夠得到進(jìn)一步證實(shí)，并有望成為甲狀腺惡性腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)以及輔助診斷的指標(biāo)。