譚熙鈺，趙澤鑫，楊博，王永華

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

（2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

自然界中存在的絕大多數(shù)脂肪酶(EC 3.1.1.3)能夠催化水解甘油三酯，但是有少量的脂肪酶被鑒定為不具備接納甘油三酯(TAG)底物但能夠催化水解甘油二酯和單酯，這類脂肪酶被稱為偏甘油酯脂肪酶[1～4]。因其具有特殊的底物選擇性，所以偏甘油酯脂肪酶在食品工業(yè)和醫(yī)藥保健品生產(chǎn)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用空間。例如，使用偏甘油酯脂肪酶生產(chǎn)高純度甘油二酯(DAG)[5,6],食用乳化劑[7]，共軛亞油酸酯[8]，生物柴油[9]等。雖然偏甘油酯脂肪酶已經(jīng)被廣泛使用，但是引起其特殊底物選擇性的分子機制并不清楚。

脂肪酶的 C末端常常與其功能有密切關(guān)系。Barbara Koch等[10]人發(fā)現(xiàn)酵母甘油三酯脂肪酶Tgl3p的C末端具有結(jié)合脂質(zhì)底物和維持整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能。Hung Kuo-Sheng等[11]人通過比較來源于Candida rugosa的同源脂肪酶LIP1-LIP4的序列和功能發(fā)現(xiàn)，C末端可以調(diào)節(jié)酶的活力、熱穩(wěn)定性及界面特性。Chen C.K.等[12]人通過分析古菌Archaeoglobus fulgidus脂肪酶與多種底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其C末端能夠幫助結(jié)合長鏈的脂肪酸從而調(diào)節(jié)脂肪酶的鏈長選擇性。Broedl UC等人[13]也認為內(nèi)皮脂肪酶的C末端對其底物偏好性起到了調(diào)節(jié)作用。由此可見，脂肪酶的C末端的變化能夠?qū)ζ涔δ墚a(chǎn)生重要的影響。

現(xiàn)在已經(jīng)被鑒定并報道的偏甘油酯脂肪酶，幾乎都屬于RML真菌脂肪酶家族。該脂肪酶家族既包括了大量的甘油三酯脂肪酶，如被廣泛應(yīng)用的米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor mieheilipase，RML)，疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosuslipase，TLL)和米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzaelipase，ROL)等，也擁有沙門柏干酪青霉脂肪酶(Penicillium camembertilipase，PCL)，米曲霉脂肪酶(Aspergillus oryzaelipase，AOL)，馬來色球菌(Malassezia globosa)脂肪酶LIP和MgMDL2等偏甘油酯脂肪酶。這些脂肪酶基因雖然來源于不同的真菌，但是它們都具有一定的序列和空間相似性[14]。同時，大量RML家族脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析[15～17]，這為研究偏甘油酯脂肪酶特異的底物選擇性的分子基礎(chǔ)提供了可能。本研究將通過序列比對和結(jié)構(gòu)分析的方法發(fā)現(xiàn)甘油三酯脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶的差異，再以甘油三酯脂肪酶TLL為模板，將不保守的偏甘油酯脂肪酶AOL的C端與TLL進行置換，考察并總結(jié)酶突變體的生化特性變化規(guī)律，從而揭示調(diào)節(jié)脂肪酶底物選擇性的分子基礎(chǔ)。

表1 TLL突變體的短引物序列Table 1 Short primers for TLL mutant

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

重組疏棉狀嗜熱絲孢菌TLL脂肪酶質(zhì)粒PGAPZαA-TLL由本實驗室構(gòu)建并保存。PrimeSTAR高保真DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶DpnI購于大連寶生物有限公司(TaKaRa)；酵母提取物和蛋白胨購自英國Oxoid公司；突變引物、博來霉素和BCA蛋白定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；三油酸甘油酯和油酸購于Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。主要儀器有大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司PCR儀、美國Waters 1525高效液相色譜儀和瑞士Tecan公司Infinite F50酶標(biāo)儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變體TLL_CC的構(gòu)建

基于QuikChangeTMPCR擴增的突變方法將AOL的C端置換至TLL。考慮到突變的片段太長，先合成了四條短引物，序列見表 1，將合成的短引物等體積混合以擴增出全長突變引物5’-GTGACCCGAAAC GATATTGTCAAAATTGAAGGTTATGTTAATTTT AAGGGCAATACAGGTACATCCGGAGGTTTACCT GATTTGTTGGCTTTTCATGCACATTTGTGGTATT TTGGGTTAATTGGGACA-3’。擴增全長突變引物的反應(yīng)體系見表2。

表2 全長突變引物擴增的反應(yīng)體系Table 2 Reaction system for amplifying full-length primer of mutant

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，20個循環(huán)；72 ℃1 min。再以PGAPZαA-TLL為模板，上一步PCR擴增產(chǎn)物為引物擴增出置換 C末端的突變體質(zhì)粒PGAPZαA-TLL_CC，PCR反應(yīng)體系見表3。

表3 突變體質(zhì)粒擴增的反應(yīng)體系Table 3 Reaction system for amplifying plasmid of mutant

PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸4 min，31 個循環(huán)；72 ℃10 min。

通過限制性內(nèi)切酶 DpnI對模板進行消化，將突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，完成突變體的構(gòu)建。突變體質(zhì)粒通過DNA測序驗證，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33中表達。

1.2.2 TLL脂肪酶及突變體的表達與純化

將種子液按5%的接種量接至500 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)72 h。將發(fā)酵液在4 ℃，12000 r/min離心10 min除去菌體，上清液經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后，用10000 u切向流超濾膜包濃縮并換鹽至pH 8.0的20 mM Tris-HCl緩沖液。使用Q陰離子交換(Q-Sepharose FF)層析純化，以pH 8.0含0.15 M NaCl 20 mM Tris-HCl緩沖液洗脫，得到高純度蛋白。

1.2.3 溫度和pH對TLL脂肪酶及突變體活力的影響

TLL脂肪酶及突變體的水解活力使用乳化橄欖油法[18]測定。在100 mL的反應(yīng)瓶中分別加入4 g橄欖油乳化液和5 g緩沖液。對照組先在反應(yīng)瓶中加入10 mL 95%乙醇，再將實驗組和對照組放入一定溫度的水浴搖床預(yù)孵育。待孵育5 min后，將1 mL酶液分別加入到對照組和實驗組中反應(yīng) 5 min，再迅速往實驗組中加入10 mL 95%乙醇終止反應(yīng)。以1%酚酞為指示劑，用0.05 mol/L NaOH滴定的方法確定反應(yīng)瓶中混合物的酸價，以此計算酶活。

在確定溫度對脂肪酶活力的試驗中，水浴搖床設(shè)置的溫度分別為25、30、35、40、45、50、55和60 ℃，轉(zhuǎn)速為250 r/min。反應(yīng)體系中使用的緩沖液為0.1 M pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。

在確定pH對脂肪酶活力的試驗中，水浴搖床設(shè)置的溫度為35 ℃，轉(zhuǎn)速為250 r/min。反應(yīng)體系中使用的緩沖液為pH分別為4、5（0.05 M檸檬酸緩沖液）、6、7、8（0.1 M磷酸鹽緩沖液）和9（0.1 M Tris-HCl緩沖液）。

1.2.4 TLL脂肪酶及突變體的底物選擇性

1.2.4.1 甘油三酯水解實驗

在10 mL具塞反應(yīng)瓶中加入1 g三油酸甘油酯，再加入20 mM pH 7.0磷酸鹽緩沖液200 μL和50個水解酶活單位的TLL脂肪酶或其突變體TLL_CC酶液于35 ℃下反應(yīng)72 h。分別在3、6、9、12、24、36、48、60和72 h取樣，每次取30 μL，加入970 μL含0.5 g無水硫酸鈉溶解。樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾待測。

1.2.4.2 酯化實驗

在10 mL的具塞反應(yīng)瓶中加入2 g油酸和0.5 g甘油，再加入2%（W/V）的20 mM pH 7.0磷酸鹽緩沖液和含2 mg的TLL脂肪酶或其突變體TLL_CC的凍干粉于35 ℃下反應(yīng)72 h。分別在3、6、9、12、24、36、48、60和72 h取樣，每次取30 μL，加入970 μL含0.5 g無水硫酸鈉的流動相溶解。樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待檢測。

1.2.4.3 HPLC檢測油脂成分

高效液相檢測分析使用色譜柱，Phenomenex Luna 5 u silico (2) 100 ? (250 mm×4.6 mm)；流動相為正己烷-異丙醇-甲酸（體積比 15:1:0.003）；流速，1.0 mL/min；柱箱溫度，30 ℃；檢測器溫度，35 ℃；進樣量，10 μL。根據(jù)標(biāo)樣保留時間定性，記錄產(chǎn)物中各物質(zhì)峰面積。

1.2.5 同源模建

以TLL脂肪酶的開放構(gòu)象(PDB code:1EIN)為模板，使用MODELLER軟件構(gòu)建突變體 TLL_CC和AOL的開放構(gòu)象。使用CHIMERA軟件在真空中對各構(gòu)象進行能量最小化。所有的結(jié)構(gòu)圖像由PYMOL制作。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗均設(shè)三個平行并重復(fù)三次，利用GraphPad軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析以及作圖。當(dāng)p＜0.05 時，差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘油三酯脂肪酶與偏甘油酯脂肪酶的結(jié)構(gòu)分析

圖1 RML脂肪酶家族成員的多序列比對(a)及TLL脂肪酶C末端替換區(qū)(b)Fig.1 The multiple sequence alignment of RML family lipase (a)and the exchanged region in C-terminus of TLL lipase (b)

如圖1a所示，TLL脂肪酶除了與兩個甘油三酯脂肪酶 GZEL（玉米赤霉脂肪酶，Gibberella zeaelipase）和 FOL（尖孢鐮刀菌脂肪酶，F(xiàn)usarium oxysporumlipase）分別有44%和43%的序列一致性外，還分別與偏甘油酯脂肪酶PCL、PcMdL（圓弧青霉脂肪酶，Penicillium cyclopiumlipase）和AOL有42%、42%和40%的序列一致性。雖然這些RML家族脂肪酶表現(xiàn)出較高的同源性，但是在C末端均表現(xiàn)出了差異性。偏甘油酯脂肪酶在圖示區(qū)域中相對于甘油三酯脂肪酶有更多氨基酸的插入。

圖2 TLL脂肪酶和AOL脂肪酶的結(jié)構(gòu)疊合Fig.2 The structural superimposition of TLL and AOL lipases

圖3 TLL脂肪酶和突變體TLL_CC的純化電泳圖Fig.3 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of the purification of TLL and TLL_CC

另一方面，通過同源建模獲得的 AOL脂肪酶模型與TLL脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)的疊合(圖2)表明，這兩個具有不同底物選擇性的脂肪酶的整體結(jié)構(gòu)有很好的重疊性(RMSD=0.68)，僅在C末端處出現(xiàn)了大的不重疊區(qū)，且該區(qū)域與序列比對中的氨基酸插入?yún)^(qū)吻合。為了探究該區(qū)域的差異與RML家族脂肪酶的底物選擇性的關(guān)系，我們構(gòu)建了 TLL脂肪酶的突變體，將AOL脂肪酶的C末端(Y246-H266)替換TLL脂肪酶的C 末端(I241-P256)，該突變體被命名為 TLL_CC(圖1b)。野生型TLL脂肪酶和突變體TLL_CC通過Q柱純化獲得高純度蛋白，SDS-PAGE電泳圖見圖3。TLL脂肪酶的分子量大小約為35 ku，而TLL_CC的分子量略大于TLL脂肪酶，約為36 ku。經(jīng)純化后的TLL脂肪酶及突變體TLL_CC在圖中對應(yīng)分子量大小處有明顯條帶，且蛋白純度較高。

2.2 TLL和TLL_CC脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和pH

圖4 溫度(a)和pH(b)對TLL脂肪酶和突變體TLL_CC水解活力的影響Fig.4 Effect of temperature (a) and pH (b) on the hydrolytic activity of TLL lipase and mutant TLL_CC

從圖4a可以看出TLL和TLL_CC脂肪酶在pH 7.0下的活力都隨反應(yīng)溫度的變化呈現(xiàn)出拋物線的變化趨勢。TLL脂肪酶的最適溫度為50 ℃，而突變體TLL_CC的最適溫度為35 ℃。從圖4b則可以看出TLL脂肪酶和突變體TLL_CC在35 ℃、pH 4～9下的活力都隨pH的增加呈現(xiàn)出遞增的趨勢。由此可見，C末端的替換使TLL脂肪酶的最適反應(yīng)溫度下降了15 ℃，與 AOL脂肪酶接近[19]。這可能是因為插入的氨基酸在末端形成了更長且柔性更大的無規(guī)卷曲(圖2)。眾所周知，酶在催化反應(yīng)的時候需要一定的柔性，使之與底物穩(wěn)定的結(jié)合，而較高的溫度可以提供給酶分子更多的柔性。因此當(dāng)酶分子本身具有較高的柔性時則僅需要較低的溫度就能使酶的催化效果達到最佳。雖然該突變體的最適反應(yīng)溫度發(fā)生了變化，但是該區(qū)域的替換并沒有太多的帶電氨基酸參與(圖1b中TLL序列顯示僅D247為帶電氨基酸)，因此不會對TLL脂肪酶的電解狀態(tài)產(chǎn)生太大的影響，從而使其pH特性并沒有發(fā)生明顯的變化。

2.3 TLL和TLL_CC脂肪酶的底物選擇性

圖5 TLL脂肪酶(a)和突變體TLL_CC(b)催化三油酸甘油酯的水解反應(yīng)Fig.5 Time course of hydrolysis of triolein by TLL lipase (a) and mutant TLL_CC (b)

甘油三酯(TAG)的水解反應(yīng)在35 ℃、pH 7.0的條件下進行，水解產(chǎn)物包含1,3-甘油二酯(1,3-DAG)、1,2-甘油二酯(1,2-DAG)、1-甘油單酯(1-MAG)、2-甘油單酯(2-MAG)以及游離脂肪酸(FFA)。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)反應(yīng)在24 h達到平衡時，TLL脂肪酶催化的水解反應(yīng)中甘油三酯殘余28.30%，僅為TLL_CC組剩余的TAG的58.81%，表明替換C端后水解甘油三酯能力變?nèi)?。?TLL脂肪酶反應(yīng)體系中殘留的甘油二酯(DAG)比TLL_CC多2.27%。

而在相同溫度和pH的反應(yīng)條件下甘油和油酸的酯化反應(yīng)中，TLL脂肪酶和突變體都在48 h到達平衡(圖6)。此時，兩組反應(yīng)中，TLL脂肪酶催化生成的TAG含量為突變體TLL_CC的1.74倍，但其催化生成的DAG卻與突變體TLL_CC相當(dāng)，都約為38.90%，表明替換C端后酯化合成甘油三酯的能力也相應(yīng)變?nèi)酰视投サ暮铣赡芰ξ词苡绊?。以上實驗結(jié)果顯示，C末端的替換導(dǎo)致TLL脂肪酶接納TAG型底物的能力減弱，但是依舊保留了其對DAG型底物的催化能力。這也可以解釋為什么TLL脂肪酶在pH 7.0時的最佳水解活力是突變體TLL_CC的3.57倍，但是它們催化甘油和油酸酯化生成DAG的能力卻相差無幾。

圖6 TLL脂肪(a)和突變體TLL_CC(b)催化甘油和油酸的酯化反應(yīng)Fig.6 Time course of esterification of glycerol with oleic acid by TLL lipase (a) and mutant TLL_CC (b)

2.4 底物選擇性調(diào)節(jié)的分子機制

為了進一步探究C末端影響TLL脂肪酶底物選擇性的微觀原因，構(gòu)建了突變體TLL_CC的開放構(gòu)象。如圖7a所示，將TLL脂肪酶、AOL脂肪酶和突變體TLL_CC的空間結(jié)構(gòu)疊加后發(fā)現(xiàn)AOL脂肪酶和突變體TLL_CC的C末端的262和257位點較TLL脂肪酶在螺旋α8(圖2)的N端多出了一個疏水側(cè)鏈的亮氨酸覆蓋在催化活性中心上方，而TLL脂肪酶的255位的異亮氨酸在AOL脂肪酶和突變體TLL_CC中也都被苯丙氨酸取代。在TLL脂肪酶中，覆蓋在其催化口袋上的I255與W97之間的距離為9.9 ?(圖 7b)。而AOL脂肪酶C末端的L262和F265與蓋子上的W89之間的距離為7.5 ?和8.0 ?，比突變體TLL_CC的L257和F260與W97之間的距離分別少1.3 ?和1.1 ?(圖7c和d)。由此可見，AOL脂肪酶由于L262、F265與W89的位阻效應(yīng)無法接納體積較大的TAG型底物而只能接納DAG型底物。相較而言，TLL脂肪酶不存在這樣的位阻效應(yīng)，其催化中心的最小寬度都已經(jīng)接近10 ?，這可以使其順利地接納TAG型底物。雖然將AOL脂肪酶的C末端置換到TLL脂肪酶上能夠加大催化口袋的位阻效應(yīng)，但是由于整體結(jié)構(gòu)的差異性，突變體TLL_CC在催化口袋的位阻比AOL脂肪酶小得多。這使得突變體 TLL_CC依然保留一定的TLL脂肪酶催化TAG型底物的能力，同時沒有影響其接納DAG底物的本能。

圖7 TLL脂肪酶、AOL脂肪酶和突變體TLL_CC的疊合圖(a)及TLL脂肪酶(b)，AOL脂肪酶(c)和突變體TLL_CC(d)的表面展示圖Fig.7 The superimposition of TLL lipase, AOL lipase and mutant TLL_CC (a) and surface representation of the catalytic pockets from TLL lipase (b), AOL lipase (c) and mutant TLL_CC (d)

3 結(jié)論

甘油二酯是一種具有保健功能的新型食用油脂，而單甘酯（MAG）及二酯單酯混合物是被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的表面活性劑，這些脂質(zhì)產(chǎn)品都可以由偏甘油酯脂肪酶高效合成[20,21]。但是，偏甘油酯脂肪酶的數(shù)量相較于甘油三酯脂肪酶而言卻十分有限。本文通過比較RML脂肪酶家族中的甘油三酯脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶的序列和空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了這兩類酶的本質(zhì)差異在于靠近催化三聯(lián)體中組氨酸的C末端。通過置換甘油三酯脂肪酶TLL的C末端并考察野生型TLL和突變體TLL_CC的催化特性，我們發(fā)現(xiàn)突變體完全保留了野生型TLL脂肪酶接納DAG型底物的能力，但是催化TAG型底物的活力大幅下降。這使得突變體TLL_CC更像是一個偏甘油酯脂肪酶。通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C末端的I255替換成F并且在螺旋α8的N端上引入一個新的疏水氨基酸L可以增加催化口袋的位阻效應(yīng)，減小催化口袋的體積，從而調(diào)節(jié)脂肪酶的底物選擇性。本研究論證了TLL脂肪酶的C末端序列或結(jié)構(gòu)對其底物選擇性的調(diào)節(jié)作用，并構(gòu)建了一種能夠應(yīng)用于工業(yè)生成食用型甘油二酯和甘油酯型乳化劑的新型脂肪酶。