杜瑞雪，汪銳，李善姬

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林 132013)(2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉 133002)

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease）是肝臟內(nèi)脂肪過度沉積導(dǎo)致的肝臟疾病，長期大量喝酒是該病發(fā)生的直接原因，早期表現(xiàn)為脂肪肝、酒精性肝炎，如能嚴(yán)格戒酒，進(jìn)行保肝治療，肝臟病變可以逆轉(zhuǎn)，如果任由其發(fā)展為肝纖維化和肝硬化，則難以逆轉(zhuǎn)[1]。所以在酒精性肝病的早期階段盡早治療，阻止肝臟病變的進(jìn)一步擴展。酒精性肝病多發(fā)生于西方國家，隨著人們生活水平的提高，社交的需要和傳統(tǒng)的“酒文化”導(dǎo)致我國脂肪肝發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其危害性已經(jīng)不可小覷，酒中的乙醇在肝臟代謝成為乙醛，大量蓄積可引起肝細(xì)胞壞死和纖維化。輕中度患者惡心、肝區(qū)隱痛，肝腫大和腹水，重度患者可發(fā)生食管靜脈曲張破裂出血，肝性腦病等。我國很多學(xué)者也已經(jīng)對該疾病的進(jìn)行深入研究，但由于酒精性脂肪肝的發(fā)病機制較為復(fù)雜涉及生理、生化、免疫和遺傳等眾多學(xué)科，研究進(jìn)展較為緩慢，治療效果不盡如人意。

枳椇（Hovenia acerba）為鼠李科枳椇屬植物（Rhamnacea genus），是我國公布的藥食兩用中藥，果實甘甜，枳椇子可入藥。在古代《唐本草》、《本草綱目》等多部醫(yī)藥著作中都對其解酒功效有具體的記載，并且現(xiàn)代的眾多藥理實驗研究表明枳椇屬植物含皂苷、黃酮和生物堿等解酒成分，其中以二氫楊梅素和黃酮類化合物中的槲皮素效果顯著。中藥的應(yīng)用時間長久且毒副作用小，療效優(yōu)于西藥[2,3]，研究表明枳椇提取物有緩解酒精肝脂肪變性和炎癥，保護(hù)肝臟損傷的作用[4～7]，謝立等[8]證明了枳椇乙酸乙酯層的有效成分含量高于其他提取層，也有實驗證實了二氫楊梅素的解酒作用[9,10]。課題組在前期研究中證明了枳椇乙酸乙酯提取層的解酒作用，故本實驗著手于枳椇乙酸乙酯層的4種單體（槲皮素、柚皮素、楊梅素、二氫楊梅素）來篩選解酒保肝的有效成分，為進(jìn)一步研究和開發(fā)有解酒保肝作用的保健食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝臟HL7702細(xì)胞株，武漢普諾賽生命科技有限公司；二氫楊梅素、槲皮素、柚皮素、楊梅素，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜，美國GIBCO公司；油紅O，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司；TG、ALT、AST檢測試劑盒，上海嵐派生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo；全自動酶標(biāo)儀，Olympus；倒置生物顯微鏡，Olympus。

1.3 實驗方法

1.3.1 人肝細(xì)胞HL7702培養(yǎng)及MTT法篩選乙醇最佳誘導(dǎo)濃度

細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為含 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿孔底加入配好的乙醇工作液（終濃度為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、2.4%、3.6%），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸出上清液，每孔加30 μL（5 mg/mL）MTT，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，全自動酶標(biāo)儀于波長570 nm檢測各孔吸光度值（A），同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO）、對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。

1.3.2 飽和油紅O觀察酒精性脂肪肝體外造模

將乙醇用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋濃度為0.6%、0.9%、1.2%的工作液，取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板培養(yǎng)，加入不同濃度乙醇工作液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸去舊培養(yǎng)液。用1 mL PBS緩沖液輕緩低漂洗3次，加4%多聚甲醛固定30 min。把飽和油紅O及去離子水按照以下比例制成油紅O稀釋液，飽和油紅O:去離子水=3:2，靜置10 min左右，濾膜過濾備用。每孔加500 μL油紅O稀釋液覆蓋孔板底部，避光染色1 h，純凈水漂洗三次，除去多余染料，倒置顯微鏡觀察。

1.3.3 MTT法篩選四種成分對乙醇造模前后細(xì)胞活性的影響

實驗分為正常對照組 N（含 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、細(xì)胞）；乙醇模型組E（0.9%酒精濃度工作液、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、細(xì)胞）；枳椇不同提取部位乙酸乙酯層4種成分（二氫楊梅素A、槲皮素B、柚皮素C、楊梅素D）的高、中、低劑量實驗組（相當(dāng)于4 mg/mL、3 mg/mL和2 mg/mL的枳椇生藥、0.9%酒精濃度工作液、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、細(xì)胞）。取對數(shù)生長期細(xì)胞于96孔板，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)24 h，加入預(yù)先配置的工作液，每孔100 μL，設(shè)10個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTT于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，再加入DMSO，酶標(biāo)儀檢測吸光度。

1.3.4 檢測肝酶ALT、AST和細(xì)胞內(nèi)TG含量

取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板培養(yǎng)24 h，0.9%乙醇工作液干預(yù)48 h，加入不同濃度藥物繼續(xù)干預(yù)48 h，收集細(xì)胞。按照試劑盒操作說明檢測肝酶ALT、AST和細(xì)胞內(nèi)TG的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較先檢驗正態(tài)性和方差齊性，若方差齊，采用單因素方差分析，若不齊采用單因素ANOVA兩兩比較。選定p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT篩選乙醇誘導(dǎo)的最佳濃度

表1 不同濃度乙醇作用于HL7702肝細(xì)胞后細(xì)胞的活性情況Table 1 The HL7702 cells activity change by different concentration ethanol

MTT法篩選乙醇造模的最佳誘導(dǎo)濃度，酶標(biāo)儀檢測吸光度，計算細(xì)胞活性變化，結(jié)果見表 1。當(dāng)乙醇濃度為0.9%時，體外造模效果最好。由表1結(jié)果可知，與對照組相比，乙醇濃度為0.3%、0.6%時，細(xì)胞活性在100%以上，OD值較對照組稍增高，顯微鏡下觀察這兩種濃度下細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)和對照組相比無明顯改變，生長良好，當(dāng)乙醇濃度為0.9%、1.2%時，細(xì)胞活性分別為95.62%、85.01%，OD值與對照組相比稍下降，細(xì)胞形態(tài)稍有增大，生長正常；當(dāng)乙醇濃度為2.4%、3.6%時，細(xì)胞活性在80%以下，OD值與對照組相比下降較明顯，肝細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞存活率也明顯下降。根據(jù) MTT檢測結(jié)果、細(xì)胞活性變化再結(jié)合顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可以選擇乙醇濃度為0.9%或1.2%工作液建立脂肪肝模型進(jìn)行接下來藥物篩檢工作。

2.2 觀察乙醇造模后細(xì)胞內(nèi)的脂滴情況

油紅O染色觀察發(fā)現(xiàn)用0.9%乙醇體外造模脂肪肝細(xì)胞效果最好，細(xì)胞腫脹變圓，脂肪顆粒清晰可見。正常對照組細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀態(tài)良好，胞漿內(nèi)無明顯脂滴形成；乙醇組細(xì)胞形態(tài)有不同程度的改變，細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞內(nèi)有橘紅色脂滴形成。0.9%濃度乙醇組細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒呈連珠狀排列，界限清楚且分布均勻；1.2%濃度乙醇組細(xì)胞內(nèi)也有較多脂滴顆粒，但是分布不均勻，排列雜亂無序脂滴顆粒之間界限模糊，部分細(xì)胞出現(xiàn)胞膜破裂，細(xì)胞脫壁現(xiàn)象也明顯。為提高實驗的準(zhǔn)確性，減少干擾因素，故結(jié)合表1實驗結(jié)果，本試驗最終選用濃度0.9%乙醇進(jìn)行體外酒精性脂肪肝造模。

2.3 四種成分對乙醇造模細(xì)胞的影響

表2 4種成分對乙醇造模細(xì)胞的影響Table 2 The Effects of 4 components on ethanol model cells

四種成分干預(yù)造模后細(xì)胞，MTT法檢測藥物對細(xì)胞的存活率影響，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，二氫楊梅素和槲皮素干預(yù)造模細(xì)胞的存活率為94%～95%，OD值與對照組相比略有下降但與模型組相比略有上升，說明這兩種藥物對體外酒精性脂肪肝細(xì)胞的效果明顯。與對照組相比，枳椇乙酸乙酯層 4種單體對酒精性脂肪肝模型進(jìn)行干預(yù)，二氫楊梅素和槲皮素干預(yù)細(xì)胞后整體活性高于模型組，而柚皮素對細(xì)胞活性幾乎無影響；組內(nèi)比較，二氫楊梅素與槲皮素干預(yù)脂肪肝模型，隨著藥物劑量的增加細(xì)胞活性呈相對增加趨勢，楊梅素只有高劑量組對細(xì)胞活性有微弱影響，柚皮素幾乎無變化。

2.4 藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測

檢測藥物干預(yù)造模細(xì)胞后TG含量的變化，結(jié)果見表 3。細(xì)胞內(nèi)甘油三指的含量是檢測脂肪肝的一項重要指標(biāo)，造模細(xì)胞的TG含量增加，二氫楊梅素和槲皮素干預(yù)脂肪肝細(xì)胞，TG含量相對減少，說明二氫楊梅素和槲皮素可以緩解脂肪肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的代謝紊亂。由表3結(jié)果可知，模型組TG含量為0.28 mmoL/L，相比對照組0.07 mmoL/L增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），與模型組比較，除柚皮素和楊梅素的低劑量組外，其他各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量有顯著差異（p＜0.05）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素高劑量組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量為0.15 mmoL/L，低于中低劑量組，說明隨藥物濃度增加，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量減少，合成受到抑制，而其他組的差異不明顯。由此可知，二氫楊梅素有抑制細(xì)胞內(nèi)TG合成的作用，且比槲皮素、柚皮素和楊梅素的效果好。

表3 各單體干預(yù)人正常HL7702肝細(xì)胞后TG含量Table 3 The content of TG in HL7702 cells by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

表3 各單體干預(yù)人正常HL7702肝細(xì)胞后TG含量Table 3 The content of TG in HL7702 cells by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

注：a表示模型組與對照組相比，p＜0.05；b表示與模型組相比，p＜0.05；c表示與各組高劑量相比，p＜0.05。下表同。

組別 TG含量N 0.07±0.05 E（0.9%乙醇） 0.28±0.00a E+A高劑量組 0.15±0.01b中劑量組 0.18±0.00bc低劑量組 0.21±0.01bc E+B高劑量組 0.18±0.01b中劑量組 0.18±0.02b低劑量組 0.19±0.02b E+C高劑量組 0.26±0.02b中劑量組 0.27±0.005b低劑量組 0.27±0.02c E+D高劑量組 0.26±0.01b中劑量組 0.27±0.01bc低劑量組 0.27±0.01

2.5 藥物干預(yù)后細(xì)胞肝酶ALT、AST 泄漏量檢測

表4 各單體干預(yù)細(xì)胞后肝酶ALT、AST泄漏量Table 4 The leakage of ALT, AST on HL7702 by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

表4 各單體干預(yù)細(xì)胞后肝酶ALT、AST泄漏量Table 4 The leakage of ALT, AST on HL7702 by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

組別 ALT含量 AST含量N 4.56±0.01 14.19±0.00 E（0.9%乙醇） 9.79±0.01a 22.26±0.01a E+A 高劑量組 6.56±0.00b 17.15±0.01b中劑量組 7.06±0.00bc 17.95±0.04bc低劑量組 7.45±0.00bc 18.25±0.01bc E+B 高劑量組 7.33±0.01b 17.64±0.04b中劑量組 7.34±0.01b 17.71±0.02b低劑量組 7.36±0.01bc 17.84±0.01bc E+C 高劑量組 9.68±0.02b 21.84±0.02b中劑量組 9.71±0.01b 21.92±0.02bc低劑量組 9.73±0.01b 21.98±0.01bc E+D 高劑量組 9.28±0.00b 21.71±0.07b中劑量組 9.29±0.00bc 21.81±0.04b低劑量組 9.32±0.00bc 21.95±0.01b

檢測藥物干預(yù)造模細(xì)胞 ALT、AST泄漏量的變化，結(jié)果見表4。肝酶ALT、AST含量與肝損傷有關(guān)，泄漏量越多肝損傷越明顯，結(jié)果顯示，模型組ALT、AST泄漏量明顯升高，二氫楊梅素和槲皮素干預(yù)脂肪肝細(xì)胞，ALT、AST泄漏量下降明顯。由表4結(jié)果可知，模型組細(xì)胞的肝酶ALT、AST泄漏量分別為9.79 mmoL/L和22.6 mmoL/L，相比對照組4.56 mmoL/L和14.19 mmoL/L明顯升高，有顯著差異（p＜0.05）；與模型組比較，各藥物干預(yù)組的肝酶泄漏量均有顯著差異（p＜0.05），其中效果最好的是二氫楊梅素高劑量組，ALT泄漏量為6.56 mmoL/L，AST泄漏量為17.15 mmoL/L；與高劑量組相比，二氫楊梅素和楊梅素中低劑量的 ALT泄漏量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），二氫楊梅素和柚皮素中低劑量AST升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），綜合比較，二氫楊梅素抑制肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST泄漏量效果最好。

3 結(jié)論

3.1 肝臟是人體的重要解毒器官，酒精的代謝過程（90%～95%）主要在肝臟進(jìn)行，當(dāng)長期大量攝入酒精，超出肝臟的解毒能力，就會導(dǎo)致機體內(nèi)重要的生理生化代謝失衡，嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致酒精性脂肪肝。枳椇作為傳統(tǒng)解酒良藥，一直發(fā)揮它的有效作用，研究表明[3]中國傳統(tǒng)解酒良方枳椇云母湯可以通過清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、降低肝組織中細(xì)胞因子的表達(dá)起到保肝作用。

3.2 合理利用枳椇解酒護(hù)肝中的有效成分并進(jìn)行提取分離成為現(xiàn)代研究的新思路，本課題組前期實驗確定了枳椇乙酸乙酯層的解酒效果最佳，因此本次研究從乙酸乙酯層提取了4種成分，分別為二氫楊梅素、槲皮素、柚皮素和楊梅素，通過建立體外酒精性脂肪肝模型，藥物干預(yù)，檢測藥物對模型細(xì)胞的抑制率，觀察藥物干預(yù)前后細(xì)胞內(nèi)脂肪顆粒的變化，檢測細(xì)胞TG、ALT、AST含量變化，來篩選枳椇乙酸乙酯層中解酒保肝的有效成分。

3.3 實驗結(jié)果表明，二氫楊梅素的解酒效果最佳，潘仁奇[9]等人對二氫楊梅素解酒作用的研究表明，二氫楊梅素能延長醉酒小鼠的耐受時間，并能明顯地縮短醒酒的時間，證實二氫楊梅素有較好的防醉解酒效果，與本次研究結(jié)果一致，在今后的保健食品及其相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)中，考慮其解酒的藥效作用，為產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。