譚兵，龐琪期，錢波,3，王程強,3，曾榛,3，周燕園，宋家樂,3

（1.桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，廣西桂林 541100）(2.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林 541100)

(3.廣西高校預防醫(yī)學重點實驗室，廣西桂林 541100)(4.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541100）

紫甘藍又名紫包菜、紫卷心菜、紅甘藍，屬十字花科蕓薹屬甘藍種甘藍變種，通體呈紫紅色，易于栽種且營養(yǎng)價值頗高[1]。目前，植物類花色苷由于其自身所具有的抗氧化、抗衰老、調控血脂、預防冠心病等多種生物活性而成為了營養(yǎng)學領域的研究熱點。但目前對于花色苷的研究主要針對水果與豆科類植物中的藍莓、櫻桃、桑葚[2～5]及黑豆和黑米等而進行[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，紫甘藍中富含的花青素類物質具有抗氧化、抗突變、預防心血管疾病、保護肝臟、抗腫瘤細胞等多種生理功能[8]。

炎癥反應是一種非特異性免疫反應，正常水平的炎癥反應是機體對抗外界刺激所做出的生理反應。但過度的炎癥反應則是多種疾病發(fā)生的重要危險因素之一。屬于機體免疫體系中重要免疫細胞的巨噬細胞可防止外界病原物質(細菌，病毒和真菌)的侵入[9,10]?；罨蟮木奘杉毎谘装Y反應過程中，可通過激活自身體內的炎性介質酶如誘導型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)產生一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)等炎癥介質，誘導白介素-1β (IL-1β)，IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細胞因子的分泌，使其參與到機體的免疫調節(jié)中[11]。但是，由于多種原因所引起的免疫失調而所導致機體過度分泌的炎癥細胞因子會引發(fā)細胞壞死，組織損傷和退化，并因此加重炎癥，從而危及機體健康[12]。

國內外目前對于紫甘藍主要在其色素提取工藝、色素抗氧化能力等方面有較多的研究報道。而就紫甘藍總花色苷抗炎作用的研究鮮見報道。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是常見致病性革蘭氏陰性菌細胞壁中的內毒素成分，是誘發(fā)免疫反應的主要因素[13]。因此，本實驗擬利用脂多糖(1 μg/mL)誘導RAW264.7小鼠單核白血病巨噬細胞制備細胞炎癥模型，以此研究紫甘藍總花色苷對細胞炎癥反應的影響，討論其可能的機制，并為紫甘藍的開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍采購自桂林市蔬菜科學研究所。DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液、胎牛血清，美國Gibco公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，美國 Thermo Scientific公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆轉錄酶，美國Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，大連寶生物工程公司；大腸桿菌脂多糖(LPS)，美國 Sigma-Aldrich公司；IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 試劑盒，美國 Cloud colon公司；一氧化氮(NO)和前列腺素E2 (PGE2)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

723型紫外分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司；EYELA N-1001S旋轉蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；三洋 MCO-15AC二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司；Centrifuge 5418R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Biotek Elx808酶標儀，美國Bio-Tek公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀，德國BMG公司。Quant Studio TM 6 Flex PCR儀，美國Applied Biosystems公司。

1.3 實驗細胞株

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株 RAW 264.7購自中國科學院昆明細胞庫(編號：KCB200603 YJ)。

1.4 紫甘藍總花色苷的制備

新鮮紫甘藍的可食部清洗除雜后，真空冷凍干燥，粉碎，過60目篩備用。紫甘藍粉(10 g)中加入200 mL酸化乙醇溶液(80% V/V，pH 3.0)后在室溫條件下攪拌浸提5 h。濾液經(jīng)3000×g離心15 min后棄渣收集上清，30 ℃真空減壓旋轉蒸發(fā)制備濃縮提取物。使用D-101大孔樹脂吸附濃縮液，并用去離子水反復沖洗樹脂除雜數(shù)次后。使用前述酸化乙醇溶液注入大孔樹脂中吸附目標產物1 h，收集液體，30 ℃真空減壓旋轉蒸發(fā)制備濃縮提取物，最終制成紫甘藍總花色苷提取物(RCTA)，-80 ℃儲存待用。

1.5 紫甘藍提取物中總花色苷濃度的測定

在具塞比色管中加入4.5 mL的KCl-HCl緩沖液(25 mmol/L，pH 1.0)或4.5 mL的醋酸鈉-醋酸緩沖液(400 mmol/L，pH 4.5)后，分別加入0.5 mL的紫甘藍總花色苷提取物，室溫放置20 min。分別測定530 nm和700 nm處的吸光度后，依照公式：A=(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5計算總花色苷的吸光度。然后依照公式總花色苷濃度(mg/mL)=A×Mw×DF/ε×L 計算實際樣品中的花色苷濃度。其中 Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量(449.2 g/mol)；DF為稀釋因子(10)；ε是矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸收系數(shù)[26900 L/(mol·cm)]；L為比色杯光程(1 cm)。經(jīng)該法測定提取物中總花色苷含量為174.35±4.29 mg/g。

細胞接種到6孔板并按1.6.1方法分組處理，細胞濃度調節(jié)為2×105個/mL，每孔2 mL，進行24 h培養(yǎng)后，以不同質量濃度的紫甘藍總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)作用細胞，設置空白對照組、LPS組及LPS+紫甘藍總花色苷提取物組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在4 ℃下收集細胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8測定試劑盒說明書步驟操作。

1.6 紫甘藍總花色苷提取物對細胞炎癥的作用

1.6.1 細胞培養(yǎng)及分組

1.6.4 qRT-PCR法測定 RAW264.7細胞內iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8的mRNA表達

RAW264.7細胞用DMEM細胞培養(yǎng)液(含10%FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。待細胞貼壁長至培養(yǎng)皿80%時，用胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代，取指數(shù)期細胞用于實驗。以DMEM培養(yǎng)液(含LPS：1 μg/mL)處理細胞24 h制備細胞模型。模型細胞以紫甘藍總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進行后續(xù)實驗。對照組為未經(jīng)過任何處理的正常RAW264.7細胞。

1.6.2 RAW264.7細胞分泌NO和PGE2水平的檢測

細胞按照前述方法分組處理并將細胞濃度調節(jié)為2×105個/mL接種于24孔板，每孔接種1 mL，進行24 h培養(yǎng)后，以不同質量濃度的紫甘藍總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)處理細胞，設置空白對照組、LPS組及LPS+紫甘藍總花色苷提取物組，每組4個復孔，24 h后，按試劑盒說明書操作測定細胞培養(yǎng)基中NO和PGE2的含量。

按 1.6.1方法分組處理并將細胞濃度調節(jié)為2×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL，進行24 h培養(yǎng)后，同時以不同質量濃度的紫甘藍總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)作用細胞，設置空白對照組、LPS組及LPS+紫甘藍總花色苷提取物組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。12000 r/min離心5 min，棄上清，Trizol試劑盒法提取細胞內總RNA，紫外分光檢測提純后的RNA濃度用于后續(xù)實驗。取總RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18 引物(1 μL)、MLV 逆轉錄酶(1 μL)、RNases抑制劑(1 μL)及 5×Buffer (10 μL)逆轉錄成 cDNA。取適量cDNA(2 μL)用 qRT-PCR 法檢測 iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達水平。在總反應體系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye(0.4 μL)和滅菌雙蒸水(5.6 μL)，充分混勻后置于PCR儀中反應。擴增反應條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，72 ℃延伸2 min。每個基因cDNA樣本平行擴增3次，取Ct值均數(shù)，依公式計算目的基因表達量各引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

1.6.3 模型細胞中細胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平的測定

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究中，所有實驗均重復 3次，結果以均值(means)±標準偏差(SD)表示。所得實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結果與討論

2.1 紫甘藍總花色苷對 LPS處理 RAW264.7細胞分泌NO和PGE2水平的影響

圖1 紫甘藍總花色苷對LPS誘導RAW264.7細胞分泌NO和PGE2水平的影響Fig.1 Effects of RCTA on NO and PGE2 levels in LPS treated RAW264.7 cells

如圖1示，與正常組相比，RAW264.7細胞在經(jīng)LPS(1 μg/mL)處理后細胞分泌NO和PGE2的釋放量顯著升高(p＜0.05)。與 LPS組相比，紫甘藍總花色苷提取物各組均能顯著抑制 LPS處理所引起的NO與PGE2水平的釋放。NO是人體內信號傳導的重要分子，能參與細胞間、細胞內以及神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的生理調節(jié)。在炎癥反應中，NO具有一定的毒性作用，不僅能夠損傷DNA還參與NO介導的組織損傷作用，導致水腫和血滲出[14]。圖 1所示，LPS刺激組的RAW264.7細胞中NO濃度顯著高于正常對照組。而在紫甘藍總花色苷提取物作用組中、高劑量（10 μg/mL和50 μg/mL）組的NO釋放濃度顯著低于LPS模型組(抑制率分別為 36.11%和 58.51%)。PGE2也是一種常見的炎癥介質，其參與關節(jié)炎、結腸炎（癌）和肝炎（癌）等疾病過程中的多種炎癥反應。相反，抑制PGE2的產生可減輕炎癥癥狀[15]。經(jīng)紫甘藍總花色苷提取物作用模型細胞后，細胞 PGE2的溢出水平均得到顯著抑制。紫甘藍總花色苷提取物(10 μg/mL和50 μg/mL)處理后細胞PGE2溢出水平分別較未經(jīng)處理LPS模型細胞分泌水平降低29.58%和46.26%上結果說明，紫甘藍總花色苷提取物能夠有效抑制 LPS誘導RAW264.7細胞炎癥模型分泌NO和PGE2水平，具有較好抗炎效果。

2.2 甘藍總花色苷提取物對 LPS處理RAW264.7細胞中iNOS和COX-2的mRNA轉錄水平的影響

圖2 紫甘藍總花色苷對LPS誘導RAW264.7細胞中iNOS和COX-2的mRNA表達水平影響Fig.2 Effects of RCTA on mRNA expression of iNOS and COX-2 in LPS treated RAW264.7 cells

iNOS在炎癥和免疫反應刺激下，通過催化L-精氨酸并進行氧化脫氨作用最終導致 NO的產生。而COX-2是參與PGE2生物合成的關鍵酶，在炎性因子介導下COX-2表達會異常增高[16]。如圖2示，與LPS組相比，紫甘藍總花苷提取物各組均能顯著抑制iNOS和COX-2的mRNA表達。較未經(jīng)紫甘藍總花色苷提取物處理過的LPS模型組細胞而言，紫甘藍總花色苷提取物(10 μg/mL和50 μg/mL)能夠分別有效降低LPS模型細胞中iNOS的轉錄水平40.37%和65.80%。同時，紫甘藍總花色苷提取物還能顯著抑制LPS模型細胞中COX-2的轉錄水平22.47%和48.28%。抑制iNOS的mRNA轉錄水平，調控NO分泌水平；抑制COX-2的表達，下調 PGE2的生物合成，可在抑制致炎細胞因子表達的同時發(fā)揮抗炎效果[17]。

2.3 紫甘藍總花色苷提取物對 LPS處理RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平的影響

TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8是常見的炎癥細胞因子，能誘導炎癥細胞遷徙、刺激炎癥因子的釋放、激化氧化應激反應，并直接導致炎癥反應和組織損傷[18,19]。如圖3示，與對照組相比，LPS(1 μg/mL)刺激可顯著增加RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。不同濃度(1 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL)紫甘藍總花色苷提取物干預模型細胞，細胞內TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌水平均得到顯著抑制，且隨著紫甘藍總花色苷提取物濃度的增加，模型細胞上清液中各檢測因子的濃度呈趨勢下降。50 μg/mL紫甘藍總花色苷提取物對模型細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌抑制效果最佳，抑制率為36.90%、73.02%、55.87%和58.46%。

2.4 紫甘藍總花色苷提取物對 LPS處理RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA轉錄水平的影響

炎癥細胞因子通常是由單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等多種細胞產生，起介導炎癥反應的作用。當機體受到免疫應激或化學刺激時，會導致其過度分泌從而引起炎癥反應或病理損傷[20]。如圖4示，與LPS組相比，經(jīng)紫甘藍總花色苷提取物處理后的模型細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達水平呈顯著降低趨勢(p＜0.05)。當紫甘藍總花色苷提取物濃度達到50 μg/mL時，細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的 mRNA表達水平分別較未處理的模型細胞相比下降65.26%、65.84%、68.16%和44.25%。

圖3 紫甘藍總花色苷對LPS誘導RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的影響Fig.3 Effects of RBTA on TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 levels in LPS treated RAW264.7 cells

圖4 紫甘藍總花色苷對LPS誘導RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達水平影響Fig.4 Effects of RCTA on mRNA expression of TNF-α, IL-1β,IL-6 and IL-8 in LPS treated RAW264.7 cells

3 結論

本研究以LPS所誘導的RAW264.7炎癥細胞模型來研究紫甘藍總花色苷提取物對細胞炎癥反應的調控效果。實驗結果證實，紫甘藍總花色苷提取物能夠抑制炎癥模型細胞中炎性介質(NO和PGE2)，并同時抑制 LPS所誘發(fā)模型細胞中炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8)的分泌，以此降低細胞的炎癥反應。而從分子機制方面，紫甘藍總花色苷能夠有效的抑制模型細胞中炎性介質酶(iNOS和COX-2)的表達，并對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性因子的基因轉錄呈抑制調控作用。在日后的研究中，課題組將從經(jīng)典的 NF-кB通路層面來探討紫甘藍總花色苷對細胞炎癥反應的信號調控機制。