劉洋　白曉智　李小強　陳子閱　何亭

[摘要] 目的 探討負(fù)壓封閉引流（VSD）治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠的效果。 方法 選取雄性C57BL/6J小鼠300只，建立燒傷膿毒癥小鼠模型；取造模成功的80只燒傷膿毒癥小鼠按照隨機數(shù)字表法將其分為實驗組和對照組，每組各40只。實驗組創(chuàng)面處理并采用VSD治療，接負(fù)壓治療儀，調(diào)節(jié)負(fù)壓為-120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；對照組僅創(chuàng)面處理，每隔24 h更換敷料一次。統(tǒng)計兩組創(chuàng)面細(xì)菌熒光強度，創(chuàng)面皮膚血流量情況，白介素（IL）-1β、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細(xì)胞因子水平，觀察7 d累計生存率。 結(jié)果 治療前，兩組的創(chuàng)面熒光強度相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與治療前比較，治療24 h后對照組熒光信號強度顯著升高（P < 0.05），實驗組熒光強度降低（P < 0.05），且兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與治療前比較，對照組經(jīng)治療第1、2天有所降低，第3、5、7天后陸續(xù)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；實驗組治療第1、2、3、5、7天小鼠背部創(chuàng)面血流量逐漸增加且明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。經(jīng)治療，實驗組促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較對照組明顯減少，IL-8含量較對照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05），IL-10含量變化不明顯（均P > 0.05）。從第2天開始，實驗組生存率明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，可降低創(chuàng)面細(xì)菌含量，改善血液供應(yīng)，降低膿毒癥的全身炎性反應(yīng)水平，提高生存率。

[關(guān)鍵詞] 負(fù)壓封閉引流；燒傷膿毒癥；C57BL/6J小鼠；炎性反應(yīng)

[中圖分類號] R644 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of vaccum sealing drainage （VSD） on C57BL/6J mice with burn sepsis. Methods A total of 300 male C57BL/6J mice were used to establish the model of burn sepsis. Eighty burned sepsis mice successfully were divided into experimental group and control group according to random number table， 40 mice in each group. In the experimental group， the wound was disposed and treated with VSD， the negative pressure apparatus was connected， and the negative pressure was adjusted to -120 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）. In the control group， only wound treatment was performed， and dressing was replaced every 24 h. The fluorescence intensity and blood flow of wound skin， the levels of inflammatory cytokines such as IL-1β， IL-6， IL-8， IL-10， TNF-α and so on were statistically calculated in the two groups， and the cumulative survival rate of 7 d was observed. Results Before treatment， the fluorescence intensity of wound was similar between the two groups， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with before treatment， the fluorescence intensity of the control group increased significantly after 24 h of treatment （P < 0.05）， while the fluorescence intensity of the experimental group decreased compared with before treatment （P < 0.05）. The difference between the two groups was statistically significant （P < 0.05）. Compared with before treatment， the control group showed a decrease on the 1st and 2nd day after treatment， and an increase on the 3rd， 5th and 7th day after treatment， there were statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The blood flow to the wounds on the back of the experimental group gradually increased and were significantly higher than those of the control group after treatment （P < 0.05 or P < 0.01）. In the experimental group， the contents of pro-inflammatory cytokines IL-1β， IL-6 and TNF-α were significantly reduced and IL-8 was significantly increased compared with the control group （all P < 0.05）， while the changes of IL-10 were not significant （all P > 0.05）. From day 2， the survival rates of the experimental group were significantly higher than those of the control group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. Conclusion VSD treatment for C57BL/6J mice with burn sepsis can reduce bacteria content of wounds， improve blood supply， reduce systemic inflammatory response level of sepsis and improve survival rate.

[Key words] Vaccum sealing drainage； Burn sepsis； C57BL/6J mice； Inflammatory response

據(jù)統(tǒng)計[1-2]，全世界每年有超過1800萬嚴(yán)重膿毒癥病例，且每年以大于1.5%的速度遞增，而重度燒傷是膿毒癥最常見的發(fā)病原因之一。盡管現(xiàn)代重癥救治的技術(shù)水平在不斷發(fā)展進(jìn)步，但目前燒傷膿毒癥仍是重度燒傷患者后期死亡的主要原因之一，也是臨床燒傷治療的瓶頸與難題。因此，有效預(yù)防和治療燒傷膿毒癥一直是國內(nèi)外燒傷領(lǐng)域研究的熱點。

負(fù)壓封閉引流（vaccum sealing drainage，VSD）技術(shù)是近年來興起的一種促進(jìn)創(chuàng)面愈合的前沿技術(shù)，是將創(chuàng)面用聚乙烯醇材料覆蓋并用半透膜封閉，最后與中心負(fù)壓或負(fù)壓泵連接使創(chuàng)面保持相對的負(fù)壓封閉環(huán)境，通過引流管將創(chuàng)面中組織間隙中的滲出液排出體外。VSD能減輕局部組織水腫，增加創(chuàng)傷周圍血液流量，清除創(chuàng)面細(xì)菌，促進(jìn)肉芽組織形成并加速創(chuàng)面愈合[3-6]，可用于燒傷創(chuàng)面感染的早期治療。即使應(yīng)用VSD治療，臨床上仍有一些燒傷膿毒癥患者發(fā)展為難以控制的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最終導(dǎo)致患者死亡。燒傷膿毒癥的全身炎性反應(yīng)問題是亟待解決的重大科學(xué)問題。本研究采用VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，觀察其細(xì)菌量、血流及炎癥因子的變化，統(tǒng)計其生存率，以期為提高燒傷膿毒癥的治療效果、探討其作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取8～12周齡的SPF雄性C57BL/6J小鼠300只[空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2016，合格證號：20160809]，體重18～20 g。飼養(yǎng)在20～25℃室溫，濕度50%的環(huán)境中，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于后續(xù)實驗。本研究經(jīng)陜西省實驗動物倫理委員會審批同意。

1.2 方法

1.2.1 燒傷膿毒癥小鼠模型的建立 腹腔注射1%苯巴比妥鈉1 mL，麻醉成功后，固定小鼠，剪除待建模區(qū)域毛發(fā)，再用10%硫化鈉脫去殘余毛發(fā)，直至背部皮膚完全暴露。在小鼠背部脫毛區(qū)正中部位，以脊柱為中線，放置1個內(nèi)徑2 cm的圓柱狀鋼化模具，用鉗夾固定圓柱狀模型于小鼠背部，熨燙蒸汽機開機，溫度調(diào)至100℃，將模具與小鼠背部皮膚緊密貼合后，將蒸汽噴頭放入燙傷模具，蒸汽噴頭與皮膚保持1 cm的距離，溫度95～98℃，持續(xù)燙傷5 s，即可形成1個直徑2 cm的Ⅲ度燙傷圓形創(chuàng)面，通過局部創(chuàng)面注射野生型銅綠假單胞菌（ATCC27853），即建立燒傷膿毒癥小鼠模型。12 h后檢測小鼠的創(chuàng)面、各臟器，均存在細(xì)菌即為造模成功。300只實驗動物最終成功制備80只燒傷膿毒癥模型，余下均因燒傷后感染死亡。

1.2.2 治療方法 造模結(jié)束24 h后，再次對小鼠行麻醉，待麻醉成功后，消毒術(shù)區(qū)后，切除小鼠燙傷部位的壞死痂皮，并用1%過氧化氫溶液、0.2%呋喃西林和無菌生理鹽水依次蘸洗創(chuàng)面；完成對模型小鼠的切痂處理后，將80只燒傷膿毒癥小鼠按照隨機數(shù)字表法將其分為實驗組和對照組，每組各40只。其中實驗組將按創(chuàng)面形狀剪裁好的醫(yī)用聚氨酯泡沫（施樂輝醫(yī)用產(chǎn)品公司），覆蓋在創(chuàng)面上方，將剪有側(cè)孔的一次性醫(yī)用引流管的一端置入聚氨酯泡沫中，用生物半透膜（施樂輝醫(yī)用產(chǎn)品公司）將聚氨酯泡沫和創(chuàng)面一起封閉，然后接負(fù)壓治療儀（施樂輝醫(yī)用產(chǎn)品公司），調(diào)節(jié)負(fù)壓為-120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）持續(xù)負(fù)壓吸引；對照組按創(chuàng)面形狀剪裁醫(yī)用聚氨酯泡沫敷料覆蓋創(chuàng)面后，用生物半透膜封閉創(chuàng)面，每隔24 h更換敷料一次。兩組小鼠均單籠飼養(yǎng)并觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 創(chuàng)面細(xì)菌熒光強度檢測 分別于實驗24 h后，用IVIS 2000小動物活體成像系統(tǒng)（Caliper Life Science公司，美國）檢測模型動物創(chuàng)面標(biāo)記菌的熒光強度，以反映小鼠創(chuàng)面銅綠假單胞菌定殖情況，強度越強，提示燒傷創(chuàng)面銅綠假單胞菌含量越高。

1.3.2 背部創(chuàng)面皮膚血流量情況 采用PeriFlux 5000多普勒血流成像儀（Perimed公司，瑞士）于實驗第0、1、2、3、5、7 天檢測小鼠背部創(chuàng)面血流情況。

1.3.3 白介素、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細(xì)胞因子檢測 于實驗第0、1、2、3、5、7天收集創(chuàng)面滲出液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定白介素（IL）-1β、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，按照試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司）說明書操作。

1.3.4 生存分析 觀察各組7 d累計生存率，并進(jìn)行生存分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，重復(fù)測量的數(shù)據(jù)采用方差分析，兩組間比較采用t檢，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組燒傷創(chuàng)面的熒光強度

治療前，兩組的創(chuàng)面熒光強度相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；治療24 h后，對照組熒光信號強度顯著升高（P < 0.05），實驗組熒光強度降低（P < 0.05），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組背部創(chuàng)面血流量的變化情況

與治療前比較，對照組經(jīng)治療第1、2天后背部創(chuàng)面血流量有所降低，第3、5、7天后陸續(xù)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；實驗組經(jīng)治療第1、2、3、5、7天后，小鼠背部創(chuàng)面血流量逐漸增加且明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 兩組外周血中炎性細(xì)胞因子水平

ELISA檢測結(jié)果顯示，實驗組經(jīng)VSD治療后炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較對照組明顯減少，IL-8含量較對照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05），IL-10含量變化不明顯（均P > 0.05）。見圖1。

2.4 兩組燒傷膿毒癥小鼠生存率

自第2天開始，實驗組生存率明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖2。

3 討論

VSD具有創(chuàng)面封閉和免疫調(diào)控作用，是近年來興起的一種促進(jìn)創(chuàng)面愈合的前沿技術(shù)。該技術(shù)在創(chuàng)面治療中的作用已得到臨床廣泛認(rèn)可。VSD可在創(chuàng)面局部形成持續(xù)負(fù)壓，并在負(fù)壓敷料和組織細(xì)胞之間產(chǎn)生機械應(yīng)力作用于細(xì)胞，其中最重要的一種是細(xì)胞表面形成的剪切力，這種力的作用不僅有助于清除創(chuàng)面壞死組織，而且能促進(jìn)肉芽組織生長及血管生成[7-9]。大量研究[10-11]表明，這種機械應(yīng)力對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、功能以及基因表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用，更為重要的是可促使單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的增生和趨化。本研究采用VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，實驗組的熒光信號強度較對照組顯著降低（P < 0.05），提示VSD可以有效縮小燒傷感染創(chuàng)面面積，降低創(chuàng)面細(xì)菌含量。實驗組經(jīng)治療第1、2、3、5、7天后小鼠背部創(chuàng)面血流量逐漸增加且明顯高于對照組（P < 0.05或P < 0.01），提示實驗組小鼠創(chuàng)面及創(chuàng)周血液供應(yīng)良好，可能與VSD治療能夠清除創(chuàng)面代謝廢物，提供營養(yǎng)、氧分，改善創(chuàng)面微環(huán)境，加速創(chuàng)面愈合有關(guān)。

適度的炎性反應(yīng)可以調(diào)動機體免疫防護(hù)，清除細(xì)菌及壞死組織，保護(hù)宿主，但失控的、過度的炎性反應(yīng)則可以導(dǎo)致組織損傷[12]。燒傷后由感染所致的全身性炎性反應(yīng)與代償性抗炎反應(yīng)綜合征相互作用的失衡即為燒傷膿毒癥。燒傷膿毒癥是燒傷后感染誘發(fā)的全身失控性炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)生機制極其復(fù)雜，涉及數(shù)量眾多相互協(xié)同、相互誘生的免疫炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子，但其中最為關(guān)鍵的是巨噬細(xì)胞[13-15]。在燒傷膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中，巨噬細(xì)胞既是啟動細(xì)胞，也是效應(yīng)細(xì)胞，它的損傷與激活是機體發(fā)生失控性炎性反應(yīng)、燒傷膿毒癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素的刺激下，往往分泌大量炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等，造成了體內(nèi)促炎及抗炎因子的失衡，從而引發(fā)級聯(lián)瀑布效應(yīng)，最終導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控，誘發(fā)全身性損傷。因此，如何提高燒傷膿毒癥療效是亟待解決的難題。

TNF-α是炎性反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎癥介質(zhì)，其廣泛參與炎癥的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮重要作用[16-17]。無論急、慢性創(chuàng)面，經(jīng)治療后早期TNF-α在創(chuàng)面組織中顯著下調(diào)；而同樣由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的與TNF-α有協(xié)同作用的IL-1β在急性創(chuàng)面中顯著下調(diào)，在慢性創(chuàng)面中無明顯變化[18-19]。經(jīng)治療人體血清中促炎性細(xì)胞因子IL-6的水平無明顯變化[20]，IL-6與抗炎性細(xì)胞因子IL-10在體內(nèi)往往存在負(fù)相關(guān)性，治療4 h后，血清中IL-10水平顯著升高[21]。IL-8是強力的趨化因子和促血管新生因子，在調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化中起著重要作用。研究表明[22]，經(jīng)治療患者局部創(chuàng)面組織中IL-8顯著升高，但外周血中IL-8水平并無顯著升高。本研究顯示，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較對照組明顯減少，IL-8含量較對照組明顯增加（均P < 0.05），IL-10含量變化不明顯（均P > 0.05），與上述既往研究結(jié)果基本一致，提示VSD有可能通過調(diào)節(jié)局部炎性反應(yīng)降低膿毒癥的全身炎性反應(yīng)水平。

綜上所述，VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，可降低其創(chuàng)面細(xì)菌含量，改善血液供應(yīng)，降低膿毒癥的全身炎性反應(yīng)水平，提高生存率。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王凡，胡高中，陳婧，等.血清降鈣素原對燒傷膿毒癥患者預(yù)后的意義[J].中華燒傷雜志，2014，30（3）：223-226.

[2] Mann EA，Baun MM，Meininger JC，et al. Comparison of mortality associated with sepsis in the burn，trauma，and general intensive care unit patient：a systematic review of the literature [J]. Shock，2012，37（1）：14-16.

[3] Ozer MT，Coskun AK，Ozerhan IH，et al. Use of vacuum-assisted closure （VACTM） in high-energy complicated perineal injuries：analysis of nine cases [J]. Int Wound J，2011，8（6）：599-607.

[4] Fang R，Dorlac WC，F(xiàn)laherty SF，et al. Feasibility of negative pressure wound therapy during intercontinental aer-omedical evacuation of combat casualties [J]. J Trauma，2010，69（1）：140-145.

[5] 歐昌良，鄒永根，羅成，等.負(fù)壓封閉引流聯(lián)合股前外側(cè)穿支皮瓣修復(fù)足部軟組織缺損[J].中國骨傷，2018，31（7）：666-670.

[6] 蘇衛(wèi)國，王平麗，魏瑩，等.負(fù)壓封閉引流技術(shù)對重度燒傷伴全身炎癥反應(yīng)綜合征的療效評價[J].上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014，34（2）：184-188.

[7] 馬莉，胡沛，吳振清，等.封閉負(fù)壓引流技術(shù)聯(lián)合糜蛋白酶治療下頜骨創(chuàng)傷后骨髓炎的臨床應(yīng)用[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2018，53（2）：123-124.

[8] 劉重，徐虹，張朝，等.分期治療伴皮膚軟組織缺損的開放Pilon骨折療效觀察[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2013， 27（10）：1185-1189.

[9] 楊林，劉宏君，張文忠，等.改良股前外側(cè)游離穿支皮瓣橋式交叉移植修復(fù)小腿中下段軟組織缺損[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2017，31（10）：1240-1244.

[10] Lei Y，Liu L，Du SH，et al. The use of a skin-stretching device combined with vacuum sealing drainage for closure of a large skin defect：a case report[J]. J Med Case Rep，2018，12（1）：264.

[11] 張連杰，王晨，羅鵬飛，等.清創(chuàng)聯(lián)合負(fù)壓封閉引流治療因腹壁包埋異體臍帶行免疫治療導(dǎo)致的腹壁嚴(yán)重感染[J].中華燒傷雜志，2018，34（8）：556-558.

[12] Wedeking A，Hagen-Euteneuer N，Gurgui M，et al. A lipid anchor improves the protective effect of ectoine in inflammation [J]. Curr Med Chem，2014，21（22）：2565-2572.

[13] Chi YF，Chai JK，Yu YM，et al. Association between PAI-1 polymorphisms and plasma PAI-1 level with sepsis in severely burnedpatients [J]. Genet Mol Res，2015，14（3）：10 081-10 086.

[14] You B，Zhang YL，Luo GX，et al. Early application of continuous high-volume haemofiltration can reduce sepsis and improve the prognosis of patients with severe burns [J]. Crit Care，2018，22（1）：173.

[15] 呂濤，王磊，劉冰，等.連續(xù)性血漿濾過吸附治療重度燒傷膿毒癥患者的效果[J].中華燒傷雜志，2018，34（6）：370-373.

[16] 伍丹丹.TNF-α在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及治療研究進(jìn)展[J].疑難病雜志，2018，17（4）：428-432.

[17] 劉愛芬，王海寧，張曉東.纈沙坦對CVB3病毒所致急性病毒性心肌炎小鼠MCP-1與TNF-α表達(dá)的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（17）：1689-1692.

[18] Ali Rahmani S，Paknejad Z，Mohammadkhanlou M. The effects of tumor necrosis factor-α（TNF-α） and IL-1 receptor antagonist（IL-1Ra）polymorphisms on recurrent abortion in Azari women [J]. Ginekol Pol，2017，88（8）：421-427.

[19] Zubel-Lojek J，Oclon E，Latacz A，et al. Adipose tissue tumor necrosis factor-α and interleukin-6 response to glucocorticoid treatment during inflammation [J]. Folia Biol （Krakow），2016，64（3）：205-212.

[20] Wright HL，Cross AL，Edwards SW，et al. Effects of IL-6 and IL-6 blockade on neutrophil function in vitro and in vivo [J]. Rheumatology（Oxford），2014，53（7）：1321-1331.

[21] Aisiku IP，Yamal JM，Doshi P，et al. Plasma cytokines IL-6，IL-8，and IL-10 are associated with the development of acute respiratory distress syndrome in patients with severe traumatic brain injury [J]. Crit Care，2016，15（20）：288.

[22] Hartman ZC，Poage GM，den Hollander P，et al. Growth of triple-negative breast cancer cells relies upon coordinate autocrine expression of the proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8 [J]. Cancer Res，2013，73（11）：3470-3480.

（收稿日期：2018-08-07 本文編輯：任 念）