馮玥　張宗鵬　申秀萍

[摘要] 目的 觀察元胡止痛滴丸對痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法 選取雌性SPF級Wistar大鼠60只，按照體重隨機(jī)區(qū)組的方法將其分為對照組，模型組，元胡止痛滴丸小（0.2 g生藥/kg）、低（0.4 g生藥/kg）、中（0.8 g生藥/kg）、高（1.6 g生藥/kg）劑量組，每組各10只。腹腔注射縮宮素致痛誘發(fā)大鼠形成痛經(jīng)模型，腹腔注射苯甲酸雌二醇致敏后連續(xù)灌胃給藥3 d，觀察元胡止痛滴丸對痛經(jīng)引起的扭體反應(yīng)的潛伏期和扭體次數(shù)的影響，并檢測血漿中前列腺素F2α、前列腺素E2等與疼痛相關(guān)因子的水平。 結(jié)果 與模型組比較，元胡止痛滴丸低、中、高劑量組大鼠的扭體次數(shù)明顯減少（P < 0.05或P < 0.01），扭體潛伏期有延長趨勢，但由于個體差異導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差較大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與模型組比較，元胡止痛滴丸中、高劑量組大鼠血漿中β內(nèi)啡肽及前列腺素E2含量顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），去甲腎上腺素、5羥色胺及前列腺素F2α/前列腺素E2比值顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），元胡止痛滴丸高劑量組大鼠前列腺素F2α含量明顯降低（P < 0.05）；元胡止痛滴丸中、高劑量組大鼠血漿中血栓素B2、6-酮前列腺素F1α含量與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 元胡止痛滴丸在0.8～1.6 g生藥/kg劑量下對痛經(jīng)模型大鼠具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，改善外周血中與疼痛相關(guān)的前列腺素、單胺類遞質(zhì)及β-內(nèi)啡肽水平是其發(fā)揮多途徑鎮(zhèn)痛作用的可能機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 元胡止痛滴丸；鎮(zhèn)痛；痛經(jīng)；縮宮素

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（c）-0008-05

The study of analgesic effect and mechanism of Yuanhu Zhitong Dropping Pills on dysmenorrhea model rats

FENG Yue1，2 ZHANG Zongpeng1，2 SHEN Xiuping1，2 HU Jinfang1，2

1.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research New Drug Evaluation Co.， Ltd.， Tianjin 300301， China； 2.Tianjin Engineering Research Center of Drug Preclinical Assessment Technology， Tianjin 300301， China

[Abstrac] Objective To study the analgesic effect of Yuanhu Zhitong Dropping Pills on dysmenorrhea model rats and to discuss the possible mechanism. Methods Sixty female SPF grade Wistar rats were divided into control group， model group， small-dose （0.2 g crude drug/kg）， low-dose （0.4 g crude drug/kg）， medium-dose（0.8 g crude drug/kg）， high-dose（1.6 g crude drug/kg） of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group according to weight random block method， with 10 rats in each group. The model of dysmenorrhea was induced by intraperitoneal injection of oxytocin， and Yuanhu Zhitong Dropping Pills was administered by intragastric administration for 3 days after sensitized by intraperitoneal injection of estradiol benzoate. The effect of Yuanhu Zhitong Dropping Pills was observed by detecting latency stage and times of writhing response induced by dysmenorrhea， and the level of factors related to pain such as prostaglandin F2α and prostaglandin E2 in plasma were also detected. Results Compared with model group， the times of writhing response in low-dose ， medium-dose， high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the preclinical period of writhing response in low-dose， medium-dose， high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group showed an extension trend， while the standard deviation was large due to individual differences， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Compared with model group， the level of β-endorphin and prostaglandin E2 in medium-dose and high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， and the level of noradrenaline， 5-hydroxytryptamine， the ratio of prostaglandin F2α to prosta-glandin E2 decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， the level of prostaglandin F2α in high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group decreased significantly （P < 0.05）. There was no statistically significant difference on the level of thromboxane B2 and 6-Keto-prostaglandin F1α between medium-dose， high-dose of Yuanhu Zhitong Dropping Pills group and model group （P > 0.05）. Conclusion Yuanhu Zhitong Dropping Pills has significant analgesic effect on dysmenorrhea model rats with the dose of 0.8-1.6 g crude drug/kg. The multi-way analgesic effect is probably related to improved levels of pain-associated prostaglandins， monoamine transmitters， and β-endorphin in peripheral blood.

[Key words] Yuanhu Zhitong Dropping Pills； Analgesia； Dysmenorrhea； Oxytocin

元胡止痛滴丸為中藥復(fù)方制劑，由延胡索和白芷組成，具有理氣、活血、止痛之效[1]，對胃痛、痛經(jīng)、脅痛和偏頭痛有顯著療效，收錄于《中國藥典》2015年版一部，現(xiàn)已被列入國家醫(yī)保甲類藥品、國家重要保護(hù)品種目錄，并被2009版《國家基本藥物目錄（基層版）》確定為純中藥止痛藥物[2]。延胡索有活血、止痛等功效，白芷可散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿。元胡止痛方中的51種化學(xué)成分，來源于延胡索藥材的主要為生物堿類成分，來源于白芷藥材的主要為以歐前胡素、異歐前胡素為主的香豆素類成分[3]。本研究通過苯甲酸雌二醇致敏、縮宮素致痛來制備大鼠痛經(jīng)模型，探討元胡止痛滴丸對痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取雌性SPF級Wistar大鼠60只，體重180～200 g，2～3月齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物使用合格證號：SCXK（京）2012-0001，動物質(zhì)量合格證編號：11400700057537。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度范圍20～26℃，濕度范圍40%～70%，全新風(fēng)換氣次數(shù)不少于15次/h，12 h/12 h明暗交替，SPF級大鼠維持飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物與試劑

元胡止痛滴丸（天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部，棕褐色粉末，濃度2 g生藥/g，批號：20131209，臨用前加去離子水溶解）；苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠，批號：131006）；縮宮素注射液（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號：140539）；戊巴比妥鈉（德國Merck，批號：120505）；5-羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、去甲腎上腺素（NA）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）、前列腺素F2α（PGF2α）、前列腺素E2（PGE2）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）均購于武漢華美生物工程有限公司（批號分別為C2015820175、B18011509、C0119820174、C02011506、C0601620173、B18011508、B19011507）。

1.3 儀器

BT224S型電子天平（Max=220 g，d=0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)（離心半徑10 cm，上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；Varioskan Flash酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及痛經(jīng)模型的制備 采用體重隨機(jī)區(qū)組的方法將大鼠分為對照組，模型組，元胡止痛滴丸小、低、中、高劑量組，劑量分別為0.2、0.4、0.8、1.6 g生藥/kg（分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1/4、1/2、1、2倍），每組10只，參照文獻(xiàn)方法[4]建立大鼠痛經(jīng)模型，除對照組外，其余大鼠連續(xù)10 d皮下注射苯甲酸雌二醇注射液，第1、10 天每只0.5 mg/d，余日均每只0.2 mg/d。

1.4.2 給藥及扭體反應(yīng)的考察 于注射的第9天（此時動物情緒較為緊張，乳頭膨大，以往研究發(fā)現(xiàn)此時子宮變得粗大，對縮宮素變得更為敏感）開始各組按“1.4.1”中劑量灌胃給藥，對照組及模型組灌胃給5 mL/kg去離子水，連續(xù)給藥3 d，末次給藥后40 min，每只動物腹腔注射縮宮素注射液2 U，注射后立即記錄大鼠因子宮強(qiáng)烈收縮致痛經(jīng)而產(chǎn)生扭體現(xiàn)象的潛伏期及30 min內(nèi)的扭體次數(shù)，計(jì)算疼痛潛伏期延長率及扭體反應(yīng)抑制率。潛伏期超過30 min的按照30 min計(jì)。疼痛潛伏期延長率=（給藥組平均扭體潛伏期-模型組平均扭體潛伏期）/模型組平均扭體潛伏期×100%，扭體反應(yīng)抑制率=（模型組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/模型組×100%。

1.4.3 血漿各指標(biāo)的檢測 縮宮素注射1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，肝素鈉抗凝、腹主動脈取血4～5 mL，3000 r/min離心10 min取血漿，-20℃保存?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒說明書測定血漿中5-HT、NA、β-EP、PGF2α、PGE2、TXB2、6-Keto-PGF1α的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)算資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組扭體反應(yīng)比較

與對照組比較，模型組大鼠的扭體潛伏期顯著縮短（P < 0.01），扭體次數(shù)顯著增加（P < 0.01）。與模型組比較，元胡止痛滴丸低、中、高劑量組大鼠的扭體次數(shù)明顯減少（P < 0.05或P < 0.01），并呈劑量相關(guān)性；元胡止痛滴丸低、中、高劑量組大鼠扭體潛伏期有延長趨勢，但由于個體差異導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差較大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組血漿中β-EP、5-HT、NA含量比較

與對照組比較，模型組血漿β-EP含量顯著降低（P < 0.01），5-HT、NA含量顯著升高（P < 0.01）；與模型組比較，元胡止痛滴丸低、中、高劑量組β-EP含量明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），元胡止痛滴丸中、高劑量組NA、5-HT含量顯著降低（P < 0.01）。見表2。

2.3 各組血漿中前列腺素、血栓素含量比較

與對照組比較，模型組血漿中PGF2α、6-Keto-PGF1α含量以及PGF2α/PGE2比值顯著升高（P < 0.01），PGE2含量顯著降低（P < 0.01）。與模型組比較，元胡止痛滴丸高劑量組PGF2α含量明顯降低（P < 0.05）；元胡止痛滴丸中、高劑量組PGE2含量明顯升高（P < 0.05），PGF2α/PGE2比值明顯降低（P < 0.05或P < 0.01），并呈劑量相關(guān)性。元胡止痛滴丸各劑量組TXB2及6-Keto-PGF1α含量與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

痛經(jīng)是婦科最常見的癥狀之一，是指行經(jīng)前后或月經(jīng)期出現(xiàn)下腹疼痛、墜脹，伴腰酸或其他不適[5-6]，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。其中原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生主要與月經(jīng)時子宮內(nèi)膜PG、血漿縮宮素、β-EP含量上升、鈣離子的參與及鎂離子的不足有著較為密切的關(guān)系，造成子宮平滑肌收縮增強(qiáng)，血管痙攣，引起疼痛[7-9]?？s宮素可使離體子宮產(chǎn)生強(qiáng)烈而持續(xù)的收縮，引起小動脈持久而強(qiáng)烈的收縮，使子宮肌層組織缺血而導(dǎo)致類似于原發(fā)性痛經(jīng)時子宮的收縮[10]，常被用作痛經(jīng)模型的工具藥物。關(guān)于痛經(jīng)病理模型的制備，首先應(yīng)用苯甲酸雌二醇或乙烯雌酚致敏，然后應(yīng)用縮宮素或前列腺素等致痛。縮宮素為制備痛經(jīng)模型時經(jīng)常使用的致痛藥物，不僅因?yàn)槠淇梢灾苯幼饔糜谧訉m肌細(xì)胞引起子宮收縮，還可同時刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放PGF2α引起痛經(jīng)。PGF2α作用于螺旋小動脈壁上的PGF2α受體，引起子宮平滑肌痙攣性收縮，刺激子宮自主神經(jīng)疼痛纖維而發(fā)生痛經(jīng)[11]，而PGE2則能抑制子宮平滑肌的自發(fā)活動[12-13]。研究表明，痛經(jīng)患者血中PGF2α含量及PGF2α/PGE2比值升高是造成痛經(jīng)的直接原因，降低PGF2α水平或PGF2α/PGE2比值可在一定程度上緩解疼痛[14-15]。在黃體期PGE2的含量升高，抑制子宮平滑肌自發(fā)性活動，月經(jīng)期則相反，溶解酶破壞子宮內(nèi)膜細(xì)胞，釋放大量PGF2α引起子宮平滑肌收縮，月經(jīng)期子宮平滑肌對PGF2α的作用最為敏感[16-17]。

血栓素A2（TXA2）有收縮血管和聚集血小板作用，而前列腺環(huán)素（PGI2）有擴(kuò)張血管和抑制血小板聚集的作用。正常生理狀態(tài)下TXA2/PGI2處于動態(tài)平衡狀態(tài)，血管內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定。動態(tài)平衡失調(diào)時比值升高，導(dǎo)致血管收縮，使血液處于高凝狀態(tài)，是原發(fā)性痛經(jīng)的誘因之一[18]。由于TXA2、PGI2短時間內(nèi)水解成穩(wěn)定的TXB2和6-Keto-PGF1α，所以檢測TXB2、6-Keto-PGF1α的含量即可反映TXA2、PGI2的水平[19-21]。β-EP是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用，子宮是其靶器官之一。黃體期β-EP水平降低可使子宮功能活動失常，成為疼痛的原因之一[22-24]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動的重要物質(zhì)，與致痛和鎮(zhèn)痛都有著密切的關(guān)系。在外周，5-HT主要由血小板攝取和釋放，是一類重要的致痛因子，NA在外周也有致痛的作用[25]。

元胡止痛滴丸作為中藥大品種，有網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，它可能通過作用于激素調(diào)節(jié)、中樞鎮(zhèn)痛、解痙、炎癥等通路起到了治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用，為止痛的分子作用機(jī)制和主要活性成分提供了參考范圍[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子作為公認(rèn)的細(xì)胞第二信使，其濃度變化是調(diào)節(jié)子宮平滑肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵因素。Ca2+通過外鈣內(nèi)流或內(nèi)鈣釋放引起子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起能量耗竭、細(xì)胞膜受損，并直接作用于子宮平滑肌引起強(qiáng)烈收縮[28-29]，后續(xù)試驗(yàn)將著重考察對Ca2+的影響。從本研究結(jié)果中不難看出，大鼠經(jīng)苯甲酸雌二醇致敏后，腹腔注射縮宮素致痛可使子宮產(chǎn)生痙攣性收縮而形成痛經(jīng)模型，較對照組扭體反應(yīng)潛伏期明顯縮短，扭體次數(shù)顯著增加，0.8～1.6 g生藥/kg劑量的元胡止痛滴丸可顯著減少痛經(jīng)模型大鼠的扭體次數(shù)，延長疼痛潛伏期，具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，這與其調(diào)節(jié)外周血中與疼痛相關(guān)的PGF2α、PGE2、β-內(nèi)啡肽、5-HT及NA水平密切相關(guān)，是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的可能機(jī)制，其鎮(zhèn)痛作用具有多途徑的特點(diǎn)，具體作用靶點(diǎn)及環(huán)節(jié)需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：羅喬荔）