孟甦 錢邦磊 余常麟

[摘要] 目的 探明YES相關(guān)蛋白（Yes-associated protein， YAP）如何通過調(diào)控miR-29a的表達(dá)來調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)量。方法 ①以N2a細(xì)胞為研究對象，高表達(dá)及抑制YAP，測量其miR-29家族的表達(dá)量，并篩選出改變最明顯的一個miRNA，并檢測PTEN蛋白的表達(dá);②通過改變miR-29a及YAP的蛋白水平，來檢測YAP是通過何途徑來調(diào)控PTEN蛋白的表達(dá)。結(jié)果 ①通過轉(zhuǎn)染了過表達(dá)YAP質(zhì)粒后，RT-PCR的結(jié)果顯示miR-29家族中的3個成員miR-29a，miR-29b，miR-29c都明顯上調(diào)了。其中miR-29a上調(diào)了明顯。而同時抑制了YAP的細(xì)胞中，miR-29的表達(dá)量都明顯下降。說明YAP與miR-29的表達(dá)量之間是一種正相關(guān)的聯(lián)系。另外一方面，PTEN的表達(dá)量則正好與miR-29及YAP相反，在抑制了YAP后，PTEN的表達(dá)量呈現(xiàn)的上升趨勢，而過表達(dá)了YAP后，PTEN則明顯下降。這說明YAP與PTEN之間是一種負(fù)相關(guān)的聯(lián)系。②無論YAP的量改變?nèi)绾?，起到?jīng)Q定性作用的仍然還是miR-29a。下游的PTEN受YAP及miR-29a調(diào)控，而其中miR-29a作為作用中樞又受到上游YAP的調(diào)控。這些證據(jù)都揭示了YAP對PTEN的調(diào)節(jié)作用是通過對miR-29a的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。結(jié)論 該研究初步證實YAP能夠通過對miR-29a的調(diào)控來實現(xiàn)對PTEN的表達(dá)，從而為治療神經(jīng)脊髓損傷提供研究基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] YAP;miR-29a;PTEN

[中圖分類號] R329? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2018）09（a）-0021-03

Study on the Regulation of PTEN Expression by YES-related Proteins

MENG Su1， QIAN Bang-lei2， YU Chang-lin3

1.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， Jiangsu Province， 215000 China; 2.Department of Planning， Development and Performance Assessment， the Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， Jiangsu Province， 215000 China; 3.Department of Orthopedics， Changzhou Second People's Hospital， Changzhou， Jiangsu Province， 213164 China

[Abstract] Objective To explore how YES （Yes-associated protein） regulates the expression of PTEN by regulating the expression of miR-29a. Methods 1.N2a cells as the study object， high expression and inhibition of YAP， measuring the expression of the miR-29 family， and screening out the most obvious change in a miRNA， and detection of PTEN protein expression; 2.by changing the miR- Protein levels of 29a and YAP to detect the pathway by which YAP regulates PTEN protein expression. Results 1.RT-PCR showed that miR-29a， miR-29b and miR-29c were significantly up-regulated in the miR-29 family. Among them， miR-29a was significantly upregulated. In the cells that inhibited YAP at the same time， the expression of miR-29 decreased significantly. There was a positive correlation between the expression of YAP and miR-29. On the other hand， the expression level of PTEN was exactly the same as that of miR-29 and YAP. After inhibiting YAP， the expression level of PTEN showed an upward trend， while after overexpression of YAP， PTEN significantly decreased. This showed that there was a negative correlation between YAP and PTEN. 2.Regardless of how the YAP changes， the miR-29a still played a decisive role. Downstream PTEN was regulated by YAP and miR-29a， and miR-29a was centrally regulated by upstream YAP. These evidences had revealed that the regulation of PTEN by YAP was achieved through the regulation of miR-29a. Conclusion This study initially confirmed that YAP can achieve the expression of PTEN through the regulation of miR-29a， which provides a basis for the treatment of neuronal spinal cord injury.

[Key words] YAP; miR-29a; PTEN

最近的研究表明Hippo信號通路在調(diào)節(jié)動物器官與組織大小方面起到越來越重要的作用[1-2]。Yes相關(guān)蛋白作為哺乳動物Hippo通路最下游的效應(yīng)器，它的磷酸化及抑制功能受到Hippo通路成分Lats因子的調(diào)節(jié)。

1? YAP上調(diào)了miR-29a的表達(dá)量并且下調(diào)了PTEN的表達(dá)

1.1? 材料與方法

1.1.1? 主要材料及儀器? 小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞（購自上海中科院）。

1.1.2? 實驗方法? ①細(xì)胞培養(yǎng)及傳代，RT-PCR（mRNA），Western Blot; ②過表達(dá)載體及干擾質(zhì)粒的構(gòu)建;③過表達(dá)載體合成于上海生工技術(shù)有限公司;④過表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞。

1.2? 結(jié)果

通過轉(zhuǎn)染了過表達(dá)YAP質(zhì)粒后，RT-PCR的結(jié)果顯示miR-29家族中的3個成員miR-29a，miR-29b，miR-29c都明顯上調(diào)了。其中miR-29a上調(diào)了最為明顯。而同時抑制了YAP的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-29的表達(dá)量都明顯下降。這說明YAP與miR-29的表達(dá)量之間是一種正相關(guān)的聯(lián)系。如圖1所示。

另外一方面，PTEN的表達(dá)量則正好與miR-29及YAP相反，在抑制了YAP后，PTEN的表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，而過表達(dá)了YAP后，PTEN則明顯下降。這說明YAP與PTEN之間是一種負(fù)相關(guān)的聯(lián)系。如圖2所示。

2? YAP對PTEN的調(diào)節(jié)作用是通過miR-29a來實現(xiàn)的

2.1? 材料與方法

2.1.1? 主要材料及儀器? YAP過表達(dá)N2a細(xì)胞，YAP低表達(dá)N2a細(xì)胞，正常N2a細(xì)胞。

2.1.2? 實驗方法? 轉(zhuǎn)染，Western-blot，PCR（同1.1.2）。

2.2? 結(jié)果

為了研究YAP是直接調(diào)控PTEN，還是通過miR-29a來調(diào)控。在YAP KD的細(xì)胞中順轉(zhuǎn)了miR-29a mimic，同時在YAP OE的細(xì)胞中順轉(zhuǎn)了miR-29a inhibitor，通過蛋白表達(dá)分析，測出PTEN，p-AKT，AKT的表達(dá)量。在YAP OE的細(xì)胞系中，通過用miR-29a inhibitor抑制了miR-29a，然后發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)量明顯升高，而p-AKT則是下降了，與此同時，AKT并無明顯改變。而在YAP KD的細(xì)胞系中，miR-29a mimic則上調(diào)了miR-29a，PTEN的表達(dá)量是降低的，而p-AKT則上升了，同樣的，AKT表達(dá)量并無明顯改變。如圖3所示。

3? 討論

在YAP過表達(dá)后處理后的細(xì)胞中，miR-29家族的表達(dá)是明顯增加的，而其中miR-29a的表達(dá)量增加的最明顯。而PTEN蛋白明顯下降。從而揭示了YAP可以上調(diào)miR-29a，下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)這一現(xiàn)象。為了確定YAP對PTEN的這種作用是否取決于miR-29a，該次采取了兩步實驗。鑒于PTEN蛋白在神經(jīng)生長及分化方面的重要作用以及miR-29a與PTEN蛋白的關(guān)系做了一個蛋白分析和基因分析去測量PTEN的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)了YAP與PTEN之間的負(fù)相關(guān)聯(lián)系。然后，又同時調(diào)節(jié)了miR-29a和YAP的表達(dá)量。在YAP 過表達(dá)細(xì)胞中下調(diào)miR-29a，在YAP 抑制細(xì)胞中上調(diào)miR-29a。通過測量miR-29a下游的基因PTEN。發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-29a能逆轉(zhuǎn)YAP介導(dǎo)的PTEN的表達(dá)。不管YAP的改變?nèi)绾?，PTEN的表達(dá)取決于miR-29a的量。這些結(jié)果與miR-29a的改變是相同的。這說明，無論YAP的量改變?nèi)绾?，起到?jīng)Q定性作用的仍然還是miR-29a。為了進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-29a促進(jìn)神經(jīng)軸突生長是通過下調(diào)PTEN的表達(dá)及上調(diào)Akt的磷酸化。而該次的研究確實可以證明Yes相關(guān)蛋白能通過增加miR-29a的表達(dá)量來抑制PTEN蛋白。下游的PTEN受YAP及miR-29a調(diào)控，而其中miR-29a作為作用中樞又受到上游YAP的調(diào)控。這些證據(jù)都揭示了YAP對PTEN的調(diào)節(jié)作用是通過對miR-29a的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。揭示了YAP是通過miR-29a來調(diào)控PTEN的表達(dá)。而PTEN蛋白（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）作為miR-29家族的一個作用靶點，是現(xiàn)在已知與神經(jīng)細(xì)胞軸突生長息息相關(guān)的[6-8]。PTEN蛋白的抑制可以促進(jìn)神經(jīng)的生長與再生。從而為治療神經(jīng)脊髓損傷提供研究基礎(chǔ)。

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