于佳琪 趙航 楊揚 魏欣鵬 牛淑冬 李淑艷

[摘要]目的 探討內皮抑素30肽對肝癌HepG2細胞增殖活性和黏附能力的影響。方法 將內皮抑素氨基端的1～31位氨基酸（將25～31位序列由RGIRGAD改為RGDRGD）對應的核苷酸序列連接到質粒pTYB2中，再轉化至大腸埃希菌BL21（DE3）中表達，合成由30個氨基酸構成的30肽。結果 HepG2細胞經0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽分別處理24、48 h后，細胞的增殖活性和黏附能力均被抑制，呈時間劑量依賴性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 內皮抑素30肽能有效抑制HepG2細胞的增殖和黏附，在臨床上有望成為肝癌的輔助治療手段之一。

[關鍵詞]內皮抑素；增殖；黏附；肝癌

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）9（c）-0008-04

The influence of Endostatin 30 peptide on proliferative activity and adhesion ability of HepG2 cell

YU Jia-qi1 ZHAO Hang1 YANG Yang1 WEI Xing-peng1 NIU Shu-dong2 LI Shu-yan3▲

1. Qiqihar Medical School， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China； 2. Department of Physiology， Qiqihar Medical School， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China； 3. Department of Biochemistry， Qiqihar Medical School， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of Endostatin 30 peptide on proliferative activity and adhesion ability of HepG2 cell for liver cancer. Methods The nucleotide sequences corresponding to amino-terminal 1-31 amino acids of endostatin （change the 25-31 bit sequence from RGIRGAD to RGDRGD） were linked to plasmid pTYB2， then converted to the expression of Escherichia coli BL21 （DE3） and synthesize 30 peptides composed of 30 amino acids. Results After HepG2 cells were treated by 30 peptide of 0， 20， 40， 60， 80， 100 μg/ml for 24， 48 h， the proliferative activity and adhesion of cells were inhibited in time and dose dependent， and compared with the control group， there was a significant difference （P<0.05）. Conclusion Endostatin 30 peptide can effectively inhibit the proliferation and adhesion of HepG2 cell， which is expected to become one of the adjuvant therapies for liver cancer.

[Key words] Endostatin； Proliferation； Adhesion； Liver cancer

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居第二，其特點是惡性程度高，病情進展快，術后易復發(fā)和轉移。傳統(tǒng)的手術、放療和化療等的治療效果均不理想，因此，探索高效低毒的抗腫瘤新藥是醫(yī)藥衛(wèi)生工作者的首要任務。2005年，Robert等將內皮抑素分為8個肽段（hP1～hP8），分別研究其抗腫瘤活性，實驗結果顯示，內皮抑素的hP1肽段（即內皮抑素的1～27位氨基酸構成的肽段）抗腫瘤活性接近于內皮抑素，其他肽段無活性[1]。2007年黑龍江省生物醫(yī)藥工程重點實驗室劉興漢教授利用定點誘變技術對內皮抑素氨基端的1～31位氨基酸對應的核苷酸序列進行改造，并將25～31位氨基酸序列由RGIRGAD改為RGDRGD，合成了由30個氨基酸構成的30肽[2]（簡稱30肽）。改造后的30肽包含兩個RGD序列，易與腫瘤細胞膜上的整合素結合，進而增強30肽的抗腫瘤活性。本研究選擇人肝癌細胞HepG2為研究對象，探討內皮抑素30肽對HepG2細胞增殖活性和黏附能力的影響，為肝癌的生物治療提供試驗依據和臨床應用的可能性。

1材料與方法

1.1實驗材料

酵母提取物、胰蛋白胨、IPTG、EDTA、葡聚糖凝膠G15、Matrigel（E1270）（Sigma公司）；RPMI1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；胰酶（Invitrogen公司）；WST-1試劑盒（Roche公司）；幾丁質層析樹脂（NEB公司）；人肝癌細胞株HepG2（本室保存）。

1.2實驗方法

1.2.1 30肽的表達及純化 參考Wang等[3]的純化方法，從構建的pTYB2-T30基因工程表達菌中提取30肽，經幾丁質親和層析純化后，通過Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定其純度。

1.2.2 30肽對HepG2細胞生長和活力的抑制實驗 常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細胞，用0.25%的胰酶消化處于對數生長期的細胞，計數活細胞后，在96孔板中接種相同數量的HepG2細胞（每板留1個孔用作空白對照孔）。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，向各孔中分別加入30肽（濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/ml，每個濃度設5個復孔），37℃孵箱中分別處理24、48 h，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，每孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl WST-1，37℃孵育1 h。選擇450 nm為測定波長，630 nm為參考波長，用酶標儀在570 nm處測定各孔吸光度值。

1.2.3 30肽對HepG2細胞異型黏附能力的影響 本實驗將Matrigel鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，然后加入不同濃度30肽處理的HepG2細胞，MTT法檢測30肽對HepG2細胞細胞異型黏附能力的影響。

實驗參考Wickstrom等[4-5]的方法。設立對照組和30肽組。在96孔培養(yǎng)板每孔中分別鋪上2 μg Matrigel 4℃過夜，加入2%BSA 20 μl/孔，置于22℃ 1 h，PBS沖洗。HepG2細胞用0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽分別預孵育24、48 h，調整細胞密度為5×105個/ml，100 μl/孔加入細胞懸液，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育90 min。用PBS沖洗掉未黏附的細胞，加入MTT 20 μl /孔，孵育4 h后棄去MTT，加入100 μl/孔DMSO。用酶標儀在570 nm測定吸光度值，計算各組的相對黏附率，每組設3個平行對照，重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0分析數據，計量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析，采用線性回歸分析計算30肽的半數抑制濃度（IC50），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 30肽的表達及純化

重組的內皮抑素30肽經幾丁質層析樹脂親和層析后，葡聚糖凝膠G15去除DTT干擾，分別取5、2 μg進行Tricine-SDS-PAGE小肽電泳，結果見圖1，在分子量3 kDa左右出現特異條帶。

2.2 30肽對HepG2細胞增殖活性的抑制作用

在96孔板中接種相同數量的HepG2細胞，向各孔中分別加入濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽，37℃孵箱中分別處理24、48 h后，HepG2細胞的增殖活性均被抑制，呈時間劑量依賴性。應用線性回歸分析計算30肽的IC50為49.7 μg/ ml（圖2）。

2.3 30肽對HepG2細胞黏附能力的抑制作用

在HepG2細胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的30肽（0、20、40、60、80、100 μg/ml），培養(yǎng)24 、48 h，顯示30肽能顯著抑制HepG2細胞對基質膠Matrigel的黏附（P<0.05），呈時間劑量依賴性（圖3）。

3討論

腫瘤的生長、浸潤和轉移離不開新生血管的形成，內皮抑素位于膠原蛋白ⅩⅧ C末端的第一非膠原結構區(qū)域[6-7]。近年來發(fā)現其具有抑制腫瘤生長、改善肺纖維化的作用，且與其他多種疾病相關[8-10]。因此，內皮抑素日益得到研究者的關注和重視。

內皮抑素通過抑制腫瘤組織新生血管的生成，斷絕腫瘤細胞的血液供應，使細胞處于休眠狀態(tài)，間接地抑制腫瘤的生長，已作為一種抗腫瘤藥物用于臨床。但在臨床治療中，內皮抑素存在單獨注射所需劑量大，內皮抑素蛋白不穩(wěn)定，停藥后易復發(fā)等不足，對其結構進行改造以減少其毒副作用是臨床應用的發(fā)展趨勢。人工構建的30肽不僅包括內皮抑素的1～27位氨基酸活性區(qū)，還含有2個重復的由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的RGD序列[11-12]。RGD序列主要存在于細胞外基質（ECM）蛋白中，通過與多種整合素特異性結合[13-14]，促進細胞對生物材料的黏附，抑制腫瘤血管生成，進而影響腫瘤細胞的增殖、分化、轉移及凋亡等多種活動[15-16]。本研究采用WST-1試劑盒檢測細胞存活和生長活性，實驗中選擇了人肝癌HepG2細胞為實驗材料，在96孔板中接種相同數量的HepG2細胞，向各孔中分別加入濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽，37℃ 5%CO2孵箱中分別處理24、48 h后，HepG2細胞的增殖均被抑制，呈時間劑量依賴性。

腫瘤的侵襲轉移是一個連續(xù)、漸進的多因素、多步驟的動態(tài)過程，涉及原發(fā)腫瘤細胞的生存發(fā)展，腫瘤細胞增殖能力和生存能力的增強，腫瘤細胞黏附性的改變，腫瘤細胞的局部浸潤并隨著血液循環(huán)轉移等過程[17-18]。腫瘤細胞的黏附性改變在腫瘤細胞的浸潤和轉移中極為重要。細胞黏附可分為細胞與細胞間黏附及細胞與ECM黏附。細胞與細胞間黏附異常時，腫瘤細胞易從原發(fā)灶脫落并黏附到ECM和基底膜，這是腫瘤細胞侵襲轉移過程的第一步[19]。ECM的主要成分是纖維粘連蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）和Ⅳ型膠原蛋白，本研究在體外黏附實驗中采用Matrigel（主要成分是FN、LN和Ⅳ型膠原蛋白）作為黏附基質，模擬體內黏附過程。實驗顯示，HepG2細胞對人工基底膜膠Matrigel具有較強的黏附能力，加入30肽后，從40 μg/ml開始，腫瘤細胞對Matrigel的黏附能力明顯降低，并呈時間劑量依賴性，提示30肽可通過抑制腫瘤細胞對基質成分的黏附作用來降低腫瘤細胞的轉移能力，為臨床上生物活性肽用于腫瘤治療提供了理論和實驗依據[20-22]。

終上所述，內皮抑素30肽能有效抑制HepG2細胞的增殖和黏附，在臨床上有望成為肝癌的輔助治療手段之一，30肽對肝癌HepG2細胞侵襲與轉移能力的影響及機制是今后本課題的主要研究目標。

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（收稿日期：2017-12-14 本文編輯：許俊琴）