陳少茹 張誠光 陳雪婷,2 詹利之

(1 廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院,廣州,510095; 2 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州,510095; 3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所,廣州,510405)

芫花(DaphnegenkwaSieb.etZucc)為瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香屬(DaphneL.)植物,又名杜芫,老鼠花,棉花條,頭痛花,藥魚草(河北),黃陽花(陜西),野丁香花(山東),山麻皮(浙江)[1]。芫花功能與主治為瀉水逐飲,解毒殺蟲,用于水腫脹滿,胸腹積水,痰飲積聚,氣逆喘咳,二便不利,外治疥癬禿瘡,凍瘡[2-3],富含二萜類化合物,主要為瑞香烷型二萜,同時(shí)富含黃酮及雙黃酮類化合物,還有香豆素類、木脂素類,綠原酸類等多種化學(xué)成分。芫花的主要活性成分具有利尿?yàn)a下和抗生育作用[4-5],其中抗腫瘤作用為目前研究芫花的熱點(diǎn),而瑞香烷型二萜正是發(fā)揮其抗腫瘤作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[6-8]?，F(xiàn)在關(guān)于瑞香烷型二萜的報(bào)道,多集中于分離和抗腫瘤活性研究,在質(zhì)量控制方面的研究較為薄弱,缺乏系統(tǒng)評價(jià)質(zhì)量的成分研究。

本實(shí)驗(yàn)對芫花中主要的活性成分瑞香烷型二萜:yuanhuadine(1),yuanhuafine(2),genkwadaphnine(3)，yuanhuacine(2),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)進(jìn)行含量測定研究,建立有效的HPLC方法,同時(shí)測定7個(gè)具有抗腫瘤活性的二萜,并對采摘自6個(gè)不同地區(qū)的芫花中的7個(gè)二萜進(jìn)行含量測定分析,為以后芫花中瑞香烷型二萜的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。分子式見圖1。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Gilent 1200型高效液相色譜儀(四元泵、ALS、TCC、VWD和Chemstation工作站),色譜柱:ZorbaxEelipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),SartoiuSCP-225D型電子分析天平(Sartoius有限公司),BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士),金利牌超生波清洗器(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠),ALC-1100型電子分析天平(北京Sartoius科學(xué)儀器有限公司)。

圖1 芫花中7個(gè)瑞香烷型二萜

1.2 試劑 Yuanhuacine(2)對照品,批號ASD-00032031,純度95.7%,購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司,yuanhuadine(1),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7),對照品(1,3-7)為實(shí)驗(yàn)室通過對芫花分離得到,其純度分別為94.2%(1),98.1%(3),92.9%(4),94.1%(5),93.7%(6),93.9%(7),無水乙醇、磷酸均為分析純,甲醇、乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠)。

1.3 分析樣品 采集6批芫花藥材(河北、山西、陜西、甘肅、山東、江蘇),經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室李小翠副教授鑒定為瑞香科瑞香屬芫花Daphnegenkwa。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:ZorbaxEelipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:乙睛-0.1%冰醋酸水,檢測波長230 nm,進(jìn)樣量10 μL,流速0.8 mL/min,柱溫40 ℃,采用二元梯度洗脫系統(tǒng),溶劑A(乙睛),B(水、0.1%冰醋酸)梯度洗脫。見表1。

表1 流動(dòng)相梯度

2.2 對照品溶液的制備 將對照品加適量甲醇溶解,并稀釋成濃度為0.632 1,5.022,12,33,24.66,80.1 mg/mL,混合放置于4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。參照物的選擇:Yuanhuacine(2)為芫花的主要有效成分之一,且Yuanhuacine(2)與其他成分的色譜峰分離度較好,因此選擇Yuanhuacine(2)為參照物。

2.3 供試品溶液的制備 將粉碎的芫花過四號篩混勻,精密稱取芫花粉末0.25 g,放置于帶塞的錐形瓶中,精密加入75%乙醇30 mL并稱定重量,超聲處理60 min后再稱定重量,用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量,濾過并取續(xù)濾液約6 mL,過C18固相萃取小柱,棄去約2 mL濾液,其余濾液用0.45 μm的濾膜濾過即得。

2.4 提取溶劑的篩選 提取溶劑的選擇:采用超聲提取法,分別用水、90%乙醇、75%乙醇、50%乙醇和同樣濃度的甲醇進(jìn)行提取,結(jié)果75%甲醇和75%乙醇在上述色譜條件下,進(jìn)樣檢測并記錄色譜圖,所含峰數(shù)較多,分離度良好,而且75%甲醇和75%乙醇提取的效率無明顯差異,考慮到甲醇具有毒性,因此選用75%乙醇作為芫花的提取溶劑。

2.5 線性關(guān)系考察 取“2.4”項(xiàng)下各對照品儲備液適量,以甲醇依次稀釋成系列對照品溶液,分別吸取10 μL注入Gilent 1200型高效液相色譜儀進(jìn)行檢測,以各成分峰面積與對照品的進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸,得到各對照品的回歸方程和線性范圍,具體見表2。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(河北采集樣品)10 μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,結(jié)果yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面積的RSD分別為2.51%、3.84%、2.77%、2.12%、3.31%,1.35%和3.14%表明本法日內(nèi)精密度良好;取同一供試品溶液連續(xù)3 d每天進(jìn)樣3次,結(jié)果yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面積的RSD分別為2.65%、3.91%、4.11%、2.57%、1.78%、4.07%和2.46%,表明本法日間精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液,分別于24 h、12 h、8 h、4 h、2 h和0 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行檢測,yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面積的RSD分別為3.11%、2.58%、2.19%、2.14%、2.81%、3.45%和2.11%,結(jié)果顯示供試品溶液在制備后24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取芫花樣品(河北采集樣品)5份,精密稱定并按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測,結(jié)果測得yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)的平均含量分別為4.64、8.16、23.94、12.44、4.12、9.12和2.14 mg/g,RSD分別為0.5%、0.7%、0.6%、2.2%和0.5%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的芫花樣品(河北采集樣品)5份,每份0.25 g,精密加入各自對照溶液適量,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試溶液,按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2。

2.10 樣品測定結(jié)果 取6批不同產(chǎn)地的芫花樣品,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取10 μL進(jìn)樣測定,采用外標(biāo)法計(jì)算芫花樣品含量,具體結(jié)果見表3,色譜圖見圖2。

表2 7個(gè)二萜的線性、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察(n=5)

表3 不同產(chǎn)地芫花中7個(gè)瑞香烷型二萜的含量差異

圖2 中藥芫花瑞香烷型二萜的HPLC圖譜

注：1 yuanhuadine(1),2 Yuanhuacine(2),3 genkwadaphnine(3),4 yuanhuacine(4),5 yuanhuahine(5),6 yuanhualine(6),7 isoyuanhuadine(7)

3 討論

本人在做全波長掃描,考察不同吸收波長的圖譜時(shí),重點(diǎn)考察了210 μm、230 μm、254 μm、280 μm和360 μm處的圖譜特征。在230 μm處各成分具有較好的紫外吸收,基線平穩(wěn),分離度較好。因此,選擇230 μm為芫花中抗腫瘤成分瑞香烷型二萜的檢測波長。有研究顯示揮發(fā)性成分多存在于職務(wù)的根、莖、葉中,多數(shù)為萜類、芳香族類,其中萜類及其衍生物含有濃度較高的揮發(fā)油,查閱大量文獻(xiàn)[9-13]我們發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于萜類及其衍生物的提取方法多樣,有蒸餾法、超聲提純法、醇提法等,在流動(dòng)相的選擇方面,本人分別選了甲醇-水、甲醇-冰醋酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離效果不理想,在采用乙睛-水進(jìn)行檢測時(shí),分離效果進(jìn)一步提高,再嘗試加入冰醋酸改善分離效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有更好的分離效果,故選擇乙睛-0.1%冰醋酸水作為檢測芫花的流動(dòng)相。

從測定結(jié)果來看,7個(gè)瑞香烷型二萜的含量均很大,而且文獻(xiàn)報(bào)道這7個(gè)測試化合物均具有較好的抗腫瘤活性,說明我們測定的7個(gè)化合物具備較強(qiáng)的代表性;從6個(gè)不同產(chǎn)地的芫花藥材測定結(jié)果來看,7個(gè)二萜均可以被檢測到,且化合物genkwadaphnine(3)在6個(gè)產(chǎn)地的含量均較高,可以為以后深入研究芫花的質(zhì)量控制提供參考依據(jù);從總含量上看,來自甘肅的芫花藥材中7個(gè)瑞香烷型二萜含量明顯高于其他產(chǎn)地,提示二萜的含量可能和地域有關(guān),并且我們還可以看到在地處平原氣候的地區(qū)如:河北、山西、陜西、山東產(chǎn)地的藥材中瑞香烷型二萜含量較接近,而處于較為南部的江蘇省產(chǎn)地的芫花中瑞香烷型二萜則較少,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)依據(jù),我們可以推測作為次級代謝產(chǎn)物的瑞香烷型二萜的含量是和產(chǎn)地、環(huán)境因素有關(guān)的[14-16]。

本文通過色譜條件的探索研究,建立了簡單、有效的測定芫花中抗腫瘤活性成分瑞香烷二萜的方法,能夠檢測出芫花中抗腫瘤活性成分瑞香烷型二萜較高的含量,為后續(xù)更好的對這類二萜的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。