鄭 巖，鄢 超，孫景春，趙文波，何成彥，方 玲

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.門診部，吉林 長(zhǎng)春130033)

大腸癌(CRC)是全球常見的惡性腫瘤之一，包括結(jié)腸癌和直腸癌，具有很高的死亡率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查研究，新診斷為大腸癌的患者數(shù)量增加77%，預(yù)計(jì)到2030年大腸癌的死亡病例數(shù)會(huì)增加80%[1]。腎癌(RCC)是最致命的泌尿生殖系統(tǒng)癌癥之一，且呈年輕化趨勢(shì)，約占人類惡性腫瘤的3%[2]。因此，了解大腸癌和腎癌的發(fā)生發(fā)展過程對(duì)于其防治及預(yù)后至關(guān)重要。 Vinculin(紐蛋白)是一種細(xì)胞骨架蛋白，集中在鈣粘附蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞連接處的胞質(zhì)表面及整合素介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的粘著斑部位，在細(xì)胞內(nèi)高度保守[3]。 現(xiàn)已證實(shí)，vinculin通過VCL基因頭部(Vh)和尾部(Vt)相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)散、連接及黏附功能[4]。因vinculin可增強(qiáng)細(xì)胞粘附性，故將其認(rèn)為是細(xì)胞遷移的抑制劑，而癌癥的侵襲性和轉(zhuǎn)移性與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性密切相關(guān)[5]。本文應(yīng)用二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和免疫印跡技術(shù)研究 vinculin在大腸癌及腎癌組織中的表達(dá)情況，旨在探討 vinculin與大腸癌、腎癌發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所用的20例大腸癌組織、18例腎癌組織均來(lái)自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院經(jīng)外科手術(shù)切除的標(biāo)本，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)大腸癌標(biāo)本均為DukesB期腺癌，腎癌標(biāo)本均為透明細(xì)胞腎癌。手術(shù)前均經(jīng)患者同意且確定沒有接受任何治療。所取的大腸癌癌旁標(biāo)本均為位于癌組織上端距離癌邊緣10 cm之外的組織。標(biāo)本離體后，立即用生理鹽水沖洗干凈，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

二硫代蘇糖醇(DTT)、測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；2-碘乙酰胺(IAM)、BCA蛋白定量試劑盒、尿素(Urea)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；PMSF、TMED、SDS、DNA酶和RNA酶為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；LTQXL線性離子阱質(zhì)譜儀為ThermoFisher公司產(chǎn)品，1200納升級(jí)液相色譜分析儀購(gòu)于Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1組織總蛋白提取并測(cè)定濃度 取出凍存的組織樣本，充分研磨成粉末。加入裂解緩沖液(30 mmol/L Tris-HCL，9 mol/L Urea，65 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF)，室溫振蕩1h，充分溶解混合物，用RNA酶和DNA酶去除RNA和DNA，4℃離心50 min后留取上清，即為總蛋白質(zhì)?？捡R斯亮藍(lán)法染色，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和595 nm處測(cè)得的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本蛋白濃度。

1.3.2組織樣品蛋白分離及制備水解多肽混合物 對(duì)各樣本組織的總蛋白進(jìn)行電泳分離，為降低所得組織蛋白的尿素濃度，用25 mmol/L NH4HCO3進(jìn)行清洗。加入一定體積1 mol/L的DTT，56℃避光放置1 h。待反應(yīng)物降至室溫，再加入1 mol/L的2-碘乙酰胺(IAM)，室溫下避光反應(yīng)30 min。按1∶50比例加入測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶和待測(cè)蛋白37℃酶切過夜，真空抽干所得樣品，置于-80℃冰箱。

1.3.3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析分離鑒定多肽混合物 用Buffer A溶解所得樣本，各取50 μg色譜上樣，進(jìn)行反向色譜洗脫。將洗脫的多肽運(yùn)用LTQXL離子肼質(zhì)譜儀分析，再用數(shù)據(jù)依賴的方式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。

1.3.4免疫印跡試驗(yàn) 用免疫印跡試驗(yàn)再次測(cè)定目標(biāo)蛋白vinculin，驗(yàn)證其在各樣本組織中的表達(dá)情況。vinculin單克隆抗體為美國(guó)Abgent公司產(chǎn)品，內(nèi)參抗體為β-Actin。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS11.0軟件對(duì)所得的液質(zhì)聯(lián)用圖譜進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，算法依據(jù)SEQUEST法，P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于有豐度變化的蛋白質(zhì)判定標(biāo)準(zhǔn)為：其質(zhì)譜數(shù)在配對(duì)樣品中的比值≥1且差值≥72。通過二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大腸癌組織及癌旁組織、腎癌組織及癌旁組織的總蛋白分析測(cè)定，得出目標(biāo)蛋白vinculin在大腸癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，而在腎癌組織中為上調(diào)表達(dá)，vinculin質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 Vinculin質(zhì)譜圖

2.2 免疫印跡驗(yàn)證vinculin的表達(dá)情況

用Western blot檢測(cè)各組織中vinculin的表達(dá)水平。結(jié)果證明vinculin在大腸癌中的表達(dá)水平明顯低于配對(duì)的癌旁組織，結(jié)果見圖2；而腎癌組織中vinculin的表達(dá)水平高于配對(duì)的癌旁組織，結(jié)果見圖3。進(jìn)一步的驗(yàn)證了二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的鑒定結(jié)果。

圖2大腸癌中Vinculin免疫印跡圖圖3腎癌中Vinculin免疫印跡圖

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)于20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)，具有與以往不同的研究思路,其著眼點(diǎn)為目標(biāo)對(duì)象的總蛋白水平,測(cè)定分析樣本中的差異蛋白，對(duì)初步篩選與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)有著重要作用，也為腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面研究提供新的啟示[6,7]。本實(shí)驗(yàn)使用的質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)中研究最熱，最有價(jià)值的技術(shù)。

癌癥進(jìn)展中最關(guān)鍵的步驟之一是腫瘤細(xì)胞獲得侵入基底膜并進(jìn)入周圍組織的能力，這與癌癥轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和最終死亡相關(guān)。在這個(gè)過程中，腫瘤細(xì)胞通常重組他們的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架并改變其細(xì)胞形狀[8]。vinculin作為粘著斑的一個(gè)組成蛋白，對(duì)肌動(dòng)蛋白重組和細(xì)胞黏附有一定的調(diào)控作用，當(dāng)運(yùn)用siRNA干擾法對(duì)vinculin的表達(dá)進(jìn)行阻斷時(shí)，可觀察到細(xì)胞遷移顯著增加[9]。有研究表明，紐蛋白影響細(xì)胞擴(kuò)散及肌動(dòng)蛋白重組的機(jī)制是由VCL磷酸化造成的，而這種磷酸化則是SRC 激酶激發(fā)引起[10]。Rothenberg KE等人運(yùn)用新的FRET-FRAP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，紐蛋白通過與Talin或肌動(dòng)蛋白多種結(jié)合形式引起不同的機(jī)械狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)節(jié)粘著斑的細(xì)胞及組織力學(xué)敏感性，增強(qiáng)力的傳遞或重排能力[11]。目前，對(duì)vinculin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究頗熱,多篇報(bào)道指出在多種類型癌癥中vinculin上調(diào)表達(dá)。Jin GH證實(shí)，VCL的基因表達(dá)值在胃癌組織中顯著上調(diào)，表明vinculin可能通過促進(jìn)腫瘤惡性度和侵襲性參與胃癌進(jìn)展[12]；Ai J等發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中vinculin也高度表達(dá)，預(yù)示著部分患者將從VCL基因的敲低中受益[13]。還有一些研究顯示，在鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、膀胱癌等類型腫瘤中均上調(diào)表達(dá)vinculin。但并非所有類型癌組織中vinculin均為高表達(dá)。研究表明，Vinculin在大腸癌組織中低表達(dá)，且與膜結(jié)合β-catenin 成正相關(guān)，缺乏紐蛋白表達(dá)可作為大腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素[14]。

本研究運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)證實(shí)了vinculin在大腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其癌旁組織，而在腎癌組織中的表達(dá)卻顯著高于其癌旁組織，并通過免疫印跡技術(shù)得到證實(shí)。雖然多種腫瘤疾病中vinculin的表達(dá)情況有所不同，但這同時(shí)證明vinculin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，具體機(jī)制目前尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入探究。