閆 鵬,郝少飛,崔京福,劉金輝,馬玉斐,關(guān)春雷,楊小玉,王瀟然

(1.鄭州市第一人民醫(yī)院 脊柱外科,河南 鄭州450004;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科,吉林 長(zhǎng)春130041;3.吉林省人民醫(yī)院 泌尿外科,吉林 長(zhǎng)春130021)

脊髓損傷(spinal cord injury; SCI)在我國(guó)較為常見(jiàn)，是可以引起極高致殘率的傷病之一，由其導(dǎo)致的膀胱支配神經(jīng)損害均可引起神經(jīng)原性膀胱排尿功能障礙。常表現(xiàn)為膀胱感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能障礙，進(jìn)而可引起嚴(yán)重的尿潴留、尿路感染、最終導(dǎo)致腎功能衰竭，成為目前脊髓損傷病人主要的死亡原因之一[1,2]。因此能否重建SCI后病人的膀胱功能，對(duì)于提高截癱患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)此類(lèi)患者的生存期及降低死亡率具有十分顯著的意義。

本課題組前期研究表明[3,4]：長(zhǎng)期陽(yáng)極阻斷電刺激骶神經(jīng)前根(300 us脈寬、1.05 mA刺激電流)可以減少膀胱殘余尿量，提高排尿效率，增加膀胱體積，降低膀胱最大逼尿肌壓、靜息壓及逼尿肌漏點(diǎn)壓，重建膀胱順應(yīng)性，緩解逼尿肌活動(dòng)亢進(jìn)及外括約肌病理性活動(dòng)，進(jìn)而可以有效的保護(hù)上尿路，從而改善膀胱-輸尿管返流等并發(fā)癥，最終達(dá)到重建SCI后膀胱的排尿功能目的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡觀察逼尿肌超微結(jié)構(gòu)變化，探討其對(duì)膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)成年健康新西蘭白兔24只，質(zhì)量2.0-2.5 kg，雌性，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物許可證：SCXK-(吉)2008-0005，集中飼養(yǎng)兩周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理原則及方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[5],采用隨機(jī)抽樣方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，A組為假手術(shù)對(duì)照組(n=8)，B組為脊髓損傷組(n=8),C組為電刺激組(n=8)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

EM-1200EX型投射電子顯微鏡(日本)，OLYMPUS BX51電子顯微鏡(日本)，LKB-III型超薄切片機(jī)(瑞典)，多通道電生理儀( BL420 - E生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)所用骶神經(jīng)根電刺激器和刺激電極均由吉林大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)所用速眠新 Ⅱ 、蘇醒靈4號(hào)由吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部提供。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型的制備

對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔通過(guò)假手術(shù)處理：僅切除椎板并縫合切口。脊髓損傷及電刺激組實(shí)驗(yàn)兔均采用脊髓夾閉法致脊髓損傷[6]，術(shù)后所有實(shí)驗(yàn)兔均單獨(dú)安置于兔籠中飼養(yǎng)，每天3次按壓腹部幫助其排二便，墊料每日更換；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用青霉素按每公斤體重10萬(wàn)單位肌注給藥，連續(xù)用5天；手術(shù)切口每日1次消毒換藥。術(shù)后完全性SCI兔皮膚于損傷平面以下對(duì)疼痛刺激無(wú)反應(yīng),表現(xiàn)拒食，雙后肢及尾部均不能自主活動(dòng)，所有實(shí)驗(yàn)兔均存活。飼養(yǎng)10天后，SCI組及電刺激組經(jīng)尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)為神經(jīng)源性膀胱，電刺激組實(shí)驗(yàn)兔以骶1-骶4棘突為中心，依次切開(kāi)皮膚及皮下組織并暴露椎板，咬除椎板后依次顯露骶神經(jīng)前、后根。通過(guò)顯微外科技術(shù)分離并切斷雙側(cè)骶1-骶4骶神經(jīng)后根完成去傳入，然后將實(shí)驗(yàn)兔緩慢側(cè)身，改為側(cè)臥位，從而可以最大限度的減少電刺激傳入時(shí)腹壓的增加對(duì)膀胱內(nèi)壓形成的干擾。采用自制銀鉤狀電極通電刺激實(shí)驗(yàn)兔骶神經(jīng)前根，依據(jù)電刺激時(shí)導(dǎo)致的膀胱內(nèi)壓的升高變化來(lái)判斷其支配膀胱逼尿肌的優(yōu)勢(shì)神經(jīng)根(主要為骶2和骶3神經(jīng)根),然后在雙側(cè)支配逼尿肌的優(yōu)勢(shì)神經(jīng)根處各放置一枚刺激電極，輕輕縮緊鎳環(huán)，縫合并固定刺激電極。通過(guò)術(shù)后第2天對(duì)實(shí)驗(yàn)兔攝腰椎正側(cè)位X線片來(lái)確定刺激電極位置是否良好。

電刺激組實(shí)驗(yàn)兔植入刺激電極完成后第二天開(kāi)始每日進(jìn)行6次陽(yáng)極阻滯電刺激促進(jìn)排尿、排便，刺激參數(shù)為刺激脈寬300 us，刺激電流達(dá)到1.05 mA[7]，每次15-30 min，電刺激組兔電刺激時(shí)間累計(jì)達(dá)到120 h后取材。

1.3.2取材

所有的實(shí)驗(yàn)圖實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均使用速眠新進(jìn)行靜脈麻醉，取準(zhǔn)備取材實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行備皮、消毒，術(shù)者帶一次性無(wú)菌手套，取恥骨上下腹正中切口，依次切開(kāi)皮膚及皮下組織，游離腹膜及腸管后進(jìn)入盆腔，顯露膀胱后采用組織剪沿膀胱頸部橫行間斷，截取少量逼尿肌組織放置于預(yù)冷的戊二醛溶液中固定以備行透射電鏡觀察。

1.3.3透射電子顯微鏡檢查

樣品制作過(guò)程詳見(jiàn)文獻(xiàn)[4]，觀測(cè)指標(biāo)：

逼尿肌細(xì)胞形態(tài)、大小、排列及邊界是否規(guī)則，染色質(zhì)是否均勻，細(xì)胞核形態(tài)及染色深度。細(xì)胞間間距、連接方式及數(shù)量是否存在變化，細(xì)胞膜表面是否規(guī)整光滑，胞內(nèi)肌質(zhì)膜下胞飲小泡數(shù)量是否變化，胞漿內(nèi)肌絲數(shù)量有無(wú)增減，排列有無(wú)變化。胞內(nèi)各種細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等結(jié)構(gòu)是否變化，胞脊排列規(guī)則程度，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等形態(tài)學(xué)表現(xiàn),致密體分布是否均勻，核周間隙有無(wú)空間改變及空泡是否形成，細(xì)胞間隙有無(wú)縮窄，有無(wú)膠原纖維和無(wú)定形成分等。

2 結(jié)果

2.1大體組織標(biāo)本觀察脊髓損傷(SCI)組膀胱可見(jiàn)大體標(biāo)本體積減小，顏色偏向暗黃，組織表面血管網(wǎng)明顯減少，膀胱壁與周?chē)M織粘連較重，膀胱內(nèi)尿液混濁且粘稠，偶可見(jiàn)肉眼血尿，切片取材時(shí)切面可見(jiàn)部分纖維化及壞死；對(duì)照組與電刺激組實(shí)驗(yàn)兔膀胱體積與脊髓損傷組相比明顯增大，顏色粉紅，表面可見(jiàn)大量血管組成的血管網(wǎng)，膀胱壁與周?chē)M織界限清晰，膀胱內(nèi)尿液較清亮，取材切面未見(jiàn)明顯異常。

2.2超微結(jié)構(gòu)對(duì)照組膀胱逼尿肌細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞飽滿且排列整齊有序，走向均勻；細(xì)胞間距較小且致密，細(xì)胞間充斥著大量的中間連接，偶可見(jiàn)膠原及彈性纖維，細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體等細(xì)胞器且胞內(nèi)未見(jiàn)空泡狀改變。細(xì)胞核呈橢圓形或球形，核膜下可見(jiàn)異染色質(zhì)，核仁大而清晰(圖1)；脊髓損傷組表現(xiàn)為逼尿肌細(xì)胞外形不規(guī)則，大小不一且排列混亂無(wú)序，細(xì)胞間距增寬且細(xì)胞間可見(jiàn)大量的膠原纖維，胞突連接、橋粒連接及縫隙連接明顯增多，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器增多且大多呈腫脹、空泡化及脫顆粒狀改變，肌細(xì)胞內(nèi)肌絲明顯減少且走行排序紊亂，細(xì)胞膜周?chē)梢?jiàn)高電子密度物質(zhì)堆積，凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)濃縮，核膜表面凹凸不平，出現(xiàn)核固縮和核溶解(圖2)；與上述脊髓損傷組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)相比，電刺激組肌細(xì)胞形狀較為規(guī)則，大小相對(duì)均勻，凋亡細(xì)胞明顯減少，染色質(zhì)著色較淺，核固縮及核溶解消失，細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器腫脹緩解，肌細(xì)胞間間隙減小，僅見(jiàn)少量的膠原纖維，中間連接較多而胞突連接及縫隙連接較少(圖3)。

圖1對(duì)照組圖2脊髓損傷組圖3電刺激組

3 討論

臨床疾病中由于各種原因如脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)、周?chē)窠?jīng)病變等導(dǎo)致的膀胱支配神經(jīng)受損均可產(chǎn)生神經(jīng)原性膀胱進(jìn)而引起排尿功能障礙。部分患者常表現(xiàn)為殘余尿量增加,嚴(yán)重者則在出現(xiàn)腎功能損害后才進(jìn)行治療,此時(shí)膀胱逼尿肌已經(jīng)發(fā)生較為嚴(yán)重的損害,功能已產(chǎn)生嚴(yán)重下降，給后續(xù)的治療帶來(lái)很大的困難，脊髓圓錐以上層面損傷時(shí),膀胱的脊髓反射弧結(jié)構(gòu)完整，在脊髓休克緩解后，多進(jìn)展成高張力、高反射的痙攣性膀胱，臨床上常表現(xiàn)為神經(jīng)原性逼尿肌病理性活動(dòng)和逼尿肌和括約肌協(xié)同運(yùn)動(dòng)失調(diào),病人貯尿與排尿功能雙重障礙，而這種長(zhǎng)期膀胱功能紊亂會(huì)致膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，本課題組前期研究結(jié)果表明，應(yīng)用陽(yáng)極阻滯電刺激骶神經(jīng)根可以可以完全重建膀胱排尿功能(300 us脈寬、1.05 mA刺激電流)[3]，本研究旨在通過(guò)透射電鏡觀察逼尿肌超微結(jié)構(gòu)變化，探討其對(duì)膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。

膀胱逼尿肌功能上屬于平滑肌，其收縮功能與其正常的組織結(jié)構(gòu)、肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和線粒體的功能等密切相關(guān)，正常逼尿肌組織鏡下由以下三種顯微結(jié)構(gòu)組成:平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)和壁內(nèi)神經(jīng)。上述任一種結(jié)構(gòu)發(fā)生改變即可影響逼尿肌的功能，并可根據(jù)膀胱壁組織活檢以及逼尿肌切片電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)結(jié)果來(lái)判斷逼尿肌功能[8-10]。

正常的平滑肌細(xì)胞形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)基本相似,分布較為均勻,走行基本一致。細(xì)胞間可見(jiàn)大量的中間連接和散在的橋連接及縫隙連接， 細(xì)胞間距較小且均勻致密，致密區(qū)與胞飲小泡沿肌質(zhì)膜分布均勻，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等各種細(xì)胞器,肌絲數(shù)量較多，且與致密體平行排列，而脊髓損傷后除失神經(jīng)支配外，膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)也會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的改變：例如肌細(xì)胞體積增大、胞內(nèi)細(xì)胞核體積增大,線粒體減少，核內(nèi)顆粒增多,肌絲數(shù)量減少且走行紊亂，與肌絲活動(dòng)有關(guān)的密區(qū)和致密體排列混亂且不規(guī)則,胞飲小泡減少，細(xì)胞間隙增寬、分布不規(guī)則且走行不均勻，細(xì)胞間可見(jiàn)大量鋸齒狀的胞突連接以及較多緊密連接，細(xì)胞間質(zhì)大量膠原纖維和彈性纖維浸潤(rùn)，中間連接較少,正常肌束結(jié)構(gòu)消失，這些改變均可導(dǎo)致肌細(xì)胞喪失正常的收縮功能，減弱了相互間的耦聯(lián)作用,進(jìn)而導(dǎo)致逼尿肌收縮無(wú)力或無(wú)收縮[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：電刺激組相對(duì)于脊髓損傷組平滑肌較規(guī)則，形態(tài)及細(xì)胞體積明顯更接近于正常對(duì)照組，凋亡細(xì)胞減少，染色質(zhì)著色較輕，核固縮消失，肌胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹緩解，細(xì)胞間間隙縮短，膠原纖維及彈性纖維減少，中間連接增多，胞突連接及縫隙連接減少，其上述改變與對(duì)照組逼尿肌超微結(jié)構(gòu)基本相近，并沒(méi)有發(fā)生病理改變，結(jié)果表明通過(guò)陽(yáng)極阻滯電刺激骶神經(jīng)根可以重新建立膀胱逼尿肌失神經(jīng)支配，也解釋了陽(yáng)極阻滯電刺激骶神經(jīng)根時(shí)膀胱內(nèi)壓可以接近正常組膀胱內(nèi)壓，排尿時(shí)逼尿肌收縮有力。

在本研究中，我們通過(guò)采用透射電鏡方法，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期陽(yáng)極阻斷電刺激骶神經(jīng)根具有促進(jìn)神經(jīng)原性膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)的作用，穩(wěn)定膀胱內(nèi)壞境，改善膀胱排尿功能，但此過(guò)程中是否有逼尿肌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分的參與,例如提供生長(zhǎng)因子，改善細(xì)胞外內(nèi)環(huán)境成分等,有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)深入研究。