付杰文，成競(jìng)梁，邵鱗鈁，邵鱗鈞，鄭小莉，何 濤，傅俊江

（西南醫(yī)科大學(xué)：1醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心；2司法鑒定中心，四川瀘州 646000）

隨著法庭科學(xué)及檢測(cè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)資質(zhì)認(rèn)定的要求越來越高，對(duì)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats,STR）分析圖譜質(zhì)量要求也日益提高。STR是一個(gè)小的DNA片段，具有2～6個(gè)堿基對(duì)重復(fù)序列，在編碼和非編碼區(qū)域，分散在整個(gè)人類基因組中，占約3%。而現(xiàn)在STR指紋識(shí)別或DNA指紋識(shí)別可用于個(gè)體識(shí)別即親子鑒定。從最初選擇單一的一個(gè)STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳分析比對(duì)從而得出結(jié)果，到現(xiàn)在需要十幾個(gè)甚至二十幾個(gè)STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，進(jìn)行電泳和測(cè)序圖譜分析，最后才能確定親緣關(guān)系[1]。對(duì)應(yīng)當(dāng)前法醫(yī)物證檢案與DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)的需求[2-4]，一些免提取的直接擴(kuò)增試劑盒已研發(fā)和應(yīng)用，既可以達(dá)到快速高效的PCR擴(kuò)增目的[5]，又可以省下直接提取血液中DNA的時(shí)間和成本，而AGCU Expressmarker 22試劑盒就是其中的一種。該試劑盒采用五色熒光標(biāo)記、多重復(fù)合擴(kuò)增方法，對(duì)人基因組DNA中STR基因座的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，可以進(jìn)行22個(gè)基因座的同步擴(kuò)增和檢測(cè)[6-7]。現(xiàn)在的STR結(jié)果不僅需要測(cè)序圖譜質(zhì)量很好，還需要所有不同顏色熒光標(biāo)記的STR峰的平衡性好，從而增加分析結(jié)果的可信性。使用不同的采血方法采集、提取和保存血樣，由于對(duì)血樣中的DNA保護(hù)不同，最終會(huì)影響到測(cè)序結(jié)果和圖譜質(zhì)量的好壞[8-10]。為此，采血方法不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有不同的影響。本文研究是通過使用兩種不同的采血方法進(jìn)行樣本采集和保存，然后直接PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)和軟件分析所獲得的圖譜進(jìn)行比較，探討兩種不同采血方法的優(yōu)劣性，用于指導(dǎo)我們的實(shí)踐工作。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

樣本采集卡FTA血卡購自山東成武榮華生物科技有限公司，普通濾紙購自撫順市濾紙廠。AGCU Expressmarker 22試劑盒（簡(jiǎn)稱EX22試劑盒）（無錫中德美聯(lián)生物有限技術(shù)公司）[5]，臺(tái)式離心機(jī)（Thermo SCIENTIFIC），直徑大小為1 mm提取DNA的法醫(yī)用打孔器(廣州浩源科技有限公司），Veriti?熱循環(huán)儀PCR和3500 DX基因分析儀均為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血液采取

酒精棉球?qū)Ρ昏b定人或正常人進(jìn)行指尖常規(guī)消毒處理后，用FTA血卡或者普通濾紙采集2～4滴黃豆大小的血跡、自然陰涼干燥；注明被鑒定人的信息、編號(hào)，并由當(dāng)事人親自簽字確認(rèn)后，室溫運(yùn)輸和保存，或者直接用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 直接PCR擴(kuò)增

用于直接PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 μL，包括Reaction Mix 4 μL，EX22 Primers 2 μL，熱啟動(dòng)C-Taq酶 0.4 μL，ddH2O 2.6 μL[7,11-12]。取法醫(yī)用打孔器取2片1 mm孔徑濾紙片或FTA卡片作為模板。PCR程序：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)；90℃預(yù)變性30 s，58℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，共20個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。

1.2.3 電泳測(cè)序及STR數(shù)據(jù)分析

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 μL與10 μL的上樣混合物（AGCU Marker SIZ-500 30 μL+去離子甲酰胺1 000 μL）混合，短暫離心，PCR變性5 min，然后使其溫度降至室溫，再使用ABI 3500 DX基因分析儀電泳測(cè)序檢測(cè)，最后采用GeneMapper ID-X分析軟件對(duì)生成的原始文件進(jìn)行STR分析。

2 結(jié)果

2.1 使用濾紙片和EX22試劑盒直接PCR的結(jié)果

應(yīng)用濾紙片進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增和電泳分析，所有產(chǎn)物的各基因座均可獲得STR分型（圖1），圖譜顯示出10個(gè)STR座的STR峰的平衡性不好，基因座不同等位基因的峰面積差異超過30%，代表PCR擴(kuò)增不平衡。而個(gè)別STR基因座峰的峰高太低，圖譜結(jié)果不太明顯，代表擴(kuò)增時(shí)模板量過少，DNA模板降解而造成這樣的結(jié)果。代表性結(jié)果如圖1所示。此外，圖1中個(gè)別純合子峰值過低，如D16S539(黃色)。

2.2 使用FTA卡片和EX22試劑盒直接PCR的結(jié)果

應(yīng)用FTA卡片進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增和分型，STR分型圖譜清晰、準(zhǔn)確（圖2），且所有被不同顏色熒光標(biāo)記的STR基因座峰高平衡性好，所有的STR基因座之間不同等位基因的峰面積差異都在30%以內(nèi)。

2.3 兩種方法所得結(jié)果的比較分析

為了研究所得分析結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)TA卡片和濾紙片采集的隨機(jī)樣本各使用20個(gè)，共40個(gè)樣本。進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，再使用GeneMapper ID-X軟件分析STR圖譜，得出以下的匯總結(jié)果（表1）。STR綠色代表位點(diǎn)間峰高均衡性好，基因座不同等位基因的峰面積差異都在30%以內(nèi)；STR灰色代表的是工作人員修改過的數(shù)據(jù)結(jié)果，大部分都是因?yàn)槌霈F(xiàn)雜峰然后刪除導(dǎo)致的；STR黃色代表的是位點(diǎn)間峰高不均衡，基因座不同等位基因的峰面積差異都超出30%，說明PCR擴(kuò)增不平衡。通過2種方法所得結(jié)果的比較分析，結(jié)果顯示，用濾紙片采血進(jìn)行常規(guī)直接PCR擴(kuò)增的結(jié)果明顯差于FTA卡片采血進(jìn)行常規(guī)直接PCR擴(kuò)增的結(jié)果（灰黃的紙、卡比值為3.961 538）。

圖1 使用濾紙片和EX22試劑盒直接擴(kuò)增毛細(xì)管電泳代表性結(jié)果

圖2 使用FTA卡片和EX22試劑盒直接擴(kuò)增毛細(xì)管電泳代表性結(jié)果

表1 2種血樣采集方法的比較分析

3 討 論

用于遺傳分析的樣本，它們被采集和提取DNA方法有許多種[7-8,13-15]，本實(shí)驗(yàn)研究顯示的是使用不同的采血方法，進(jìn)行同一種熒光擴(kuò)增試劑盒（AGCU Expressmarker 22試劑盒）[16-17]直接PCR擴(kuò)增，且PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序都相同。而在常染色體STR圖譜分析中，良好的復(fù)合擴(kuò)增體系，各基因座的片段峰信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)比較接近。且純合子STR基因座擴(kuò)增峰的峰高和面積均比雜合子高，而雜合子中的兩個(gè)等位基因峰高和面積相接近。經(jīng)過分析STR基因座圖譜各位點(diǎn)間峰的平衡性得出，常規(guī)直接擴(kuò)增使用FTA卡片得到的結(jié)果明顯好于使用濾紙片得到的結(jié)果。分析其主要原因是因?yàn)镕TA是一種特制的濾紙，它由專利配方的強(qiáng)力變性劑和螯合劑浸泡，纖維基質(zhì)上含有特殊的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)該特制濾紙捕捉到細(xì)胞后自動(dòng)將其裂解，并與核酸結(jié)合，維持樣品中DNA的完整性，保護(hù)核酸免于降解，免受核酸酶、氧化劑和紫外線等損壞，還能夠阻止細(xì)菌和其他微生物的生長(zhǎng)，對(duì)樣品中的DNA起到很好的保護(hù)作用，并有利于室溫運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。而濾紙片只是普通的濾紙，其上的樣品中的DNA并沒有受到任何保護(hù)，因此很容易受到各種因素降解[18]，例如：生物因素，有DNA酶等；物理因素，有紫外線等；化學(xué)因素，有強(qiáng)酸強(qiáng)堿等；以及環(huán)境因素，氣溫和空氣干濕度，例如四川瀘州，天氣濕熱，不利于樣本的常規(guī)室溫保存。有時(shí)還會(huì)受到細(xì)菌和其他微生物的污染，使所得結(jié)果沒有可信性。當(dāng)然，F(xiàn)TA卡可能含有抑制PCR擴(kuò)增的成分，但是經(jīng)過我們的對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明，這種抑制因素遠(yuǎn)小于它的優(yōu)點(diǎn)，能夠成功應(yīng)用于我們的法醫(yī)物證和親子鑒定。

4 結(jié) 論

FTA卡片能對(duì)樣品中DNA起到很好的保護(hù)作用，常規(guī)直接PCR中使用FTA卡片得到的結(jié)果明顯好于使用濾紙片得到的結(jié)果，說明采血時(shí)使用FTA卡片明顯好于濾紙片。從而使得結(jié)果更具有可靠性，有利于指導(dǎo)我們的實(shí)踐工作。當(dāng)然，使用FTA卡片直接PCR也無法保證每一種熒光標(biāo)記的STR峰的平衡性好，說明該實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)還有可改進(jìn)余地，以提高圖譜的質(zhì)量，增加其可靠性。